[发明专利]一种基于四面体嵌银结构的检测血管内皮生长因子的方法

摘要

一种基于嵌银四面体结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，属于分析化学领域。本发明通过10nm粒径的金纳米颗粒的合成、6nm粒径的银纳米颗粒的合成、金纳米粒子的包裹、金纳米粒子上单链DNA的修饰、银纳米粒子上血管内皮生长因子适配体Apt‑VEGF和信标分子4‑NTP的修饰、嵌银四面体结构的组装和表面增强拉曼散射信号强度检测，建立拉曼信号强度与血管内皮生长因子浓度的标准曲线。本发明提供了一种基于嵌银四面体结构检测血管内皮生长因子的方法，与传统的检测方法相比成本低，灵敏度高，方便快捷，具有很好的实际应用前景。

主权项

一种基于嵌银四面体结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于步骤为：（1）嵌银四面体结构的构建：a、金纳米粒子修饰单链DNA：10nm粒径的金纳米粒子采用鞣酸还原法合成；金纳米粒子溶液中加入二水合双(对‑磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，使其终浓度为0.01mg/mL，室温震荡反应包裹12h后，13000rpm 离心浓缩十倍，以10mM pH 7.4的Tris‑HCl 缓冲液重悬，溶液四等分，编号依次为Au1，Au2，Au3，Au 4；分别对应加入5’端巯基修饰的单链DNA序列1,2,3,4，即DNA1，DNA2，DNA3，DNA4，使其终浓度均为5 nM；室温孵育2h后每隔1h加入NaCl溶液,至金纳米粒子溶液中盐粒子浓度为300 mM为止；溶液室温老化24 h后离心除去未结合的单链DNA，10mM Tris‑HCl重悬待用；DNA1，DNA2，DNA3，DNA4四段单链DNA中含有与血管内皮生长因子VEGF的适配体部分互补的DNA序列，以用来与目标物VEGF产生竞争，为该发明标定VEGF浓度之用；DNA1:5’‑SH‑TTTGCCTGGA GATACATGCA CATTACGGCT TTCCCTATTA GAAGGTCTCA GGTGCGCGTT TCGGTAAGTA GACG‑3’；DNA2:5’‑SH‑TTTCGCGCAC CTGAGACCTT CTAATAGGGT TTCAGTCCACCCCCACAAAC TAGAATGCCC TTTGGGCTGT TCCGGG‑3’；DNA 3:5’‑SH‑TTTGGCCGAG GACTCCTGCT CCGCTGCGGT TTCAGTCCACCCCCACACGT CTACTTACCG TTTCAGTCCA CCCCCACACC CGGAACAGCC C‑3’；DNA 4:5’‑SH‑TTTGCCGTAA TGTGCATGTA TCTCCAGGCT TTCCGCAGCGGAGCAGGAGT CCTCGGCCTT TGGGCATTCT AGTT‑3’；b、银纳米粒子上血管内皮生长因子适配体Apt‑VEGF和4‑NTP的修饰：在聚乙烯吡咯烷酮PVP的保护下采用硼氢化钠还原硝酸银的方法合成粒径为6 nm的银纳米粒子；将所得银纳米粒子离心浓缩10倍后重悬于10mM Tris‑HCl中，加入5’端修饰有巯基的VEGF适配体序列Apt‑VEGF，使其终浓度为5nM，室温孵育过夜，离心除去未结合的适配体序列，以10mM Tris‑HCl缓冲液重悬，加入信标分子4‑NTP溶液，使信标分子4‑NTP溶液终浓度为4μM；离心去除多余的信标分子，以10mM Tris‑HCl缓冲液重悬待用；Apt‑VEGF为：5’‑SH‑TTTTTTTGTG GGGGTGGACT GGGTGGGTAC C‑3’；c、嵌银四面体结构的构建：将步骤a所得四组AuX‑DNAX溶液，以Au1‑DNA1与Au2‑DNA2，以Au3‑DNA3与Au4‑DNA4两两等体积混合，使其过夜杂交形成二聚组装体，将所得二聚体等体积组装混合，24h后得金纳米粒子四面体结构；以金纳米粒子四面体结构为单位，按四面体︰银纳米粒子为1︰3的摩尔比例加入修饰有VEGF适配体Apt‑VEGF的银纳米粒子，室温24h 杂交后得嵌银四面体结构；（2）表面增强拉曼信号检测，建立嵌银四面体结构的拉曼信号与VEGF浓度的标准曲线：向步骤c所制得的嵌银四面体结构中分别加入VEGF标准品，使得VEGF终浓度分别为0 fM，0.01fM，0.05fM，0.1fM，0.5fM，1fM；室温孵育8h后，以1333cm‑1处建立拉曼信号强度变化与VEGF浓度的标准曲线。