[发明专利]一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法

摘要

一种hIL‑10重组载体，采用IMPACT系统表达，其融合蛋白标签为6个组氨酸(6×His)的重组载体，如重组载体的质粒图谱所示；重组载体的构建、表达及鉴定方法步骤包括：1)rh‑IL10基因的扩增；2)重组载体的构建、表达及其鉴定；rh‑IL10融合蛋白的纯化方法步骤为：1)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的粗提；2)包涵体洗涤；3)包涵体溶解；4)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的纯化；5)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的复性及自切割；6)IL10‑RGD纯化；增加了hIL‑10在体内的靶向性，赋予了蛋白具有抗肿瘤以及机体免疫功能的活性，更为重要的是其在伤口愈合过程中能够与新生血管内皮细胞特异靶向结合，从而预防抑制瘢痕纤维化的形成。

主权项

1.一种hIL‑10重组载体，其特征在于，采用IMPACT系统表达，其融合蛋白标签为6个组氨酸的重组载体，如重组载体的质粒图谱图1所示；所述的一种hIL‑10重组载体的构建、表达及鉴定方法包括以下步骤：(一)rh‑IL10基因的扩增1)总RNA的提取正常人外周血经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗涤2次，重悬于10％PRMI1640培养液，加入终浓度为10g/L的ConA，置5％ CO2培养箱，37℃培养48h，收集细胞，根据SigmaRNA抽提试剂盒方法，提取总RNA，‑80℃保存备用；2)RNA反转录及IL‑10 cDNA的扩增利用Takara公司反转录试剂盒，按照说明进行RT‑PCR反应：第一步去除基因组DNA，5×gDNA Eraser Buffer 2μl，gDNA Eraser 1μl，Total RNA 500ng，Rnase Free dH2O加至10μl，42℃温育2min；第二步反转录，分别加PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl，RTPrimer Mix1μl，5×PrimeScript Buffer 24μl，第一步反应液10μl，Rnase Free dH2O加至20μl，37℃温育30min，85℃反应3min后得到cDNA；(二)重组载体的构建、表达及其鉴定1)pTWIN1‑IL10表达载体的构建按大肠杆菌惯用密码子设计RGD基因序列、引物及相应的酶切位点，合成如下2条引物F1、R1；RGD导向肽氨基酸序列如下：H2N‑Cys Asp Cys Lys Gly Asp Cys Phe Cys‑COOH；RGD基因序列：5′tgt gat tgc cgt ggt gat tgt ttc tgt 3′；F1：5′GCTCTTCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAG3′BspQIR1：5′CTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACGGCAATCACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3′Pstl以F1、R1为引物，cDNA为模板，随之按95℃ 10s预变性，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，30个循环后72℃进行延伸5min，得到PCR产物，产物及pTWIN1载体分别经BspQ I/Pstl双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化DH5α，挑取单克隆，抽提质粒，进行酶切和测序鉴定，得到pTWIN1‑IL10‑RGD表达载体；2)pTWIN1‑his‑IL10表达载体的构建带有his标签his‑IL10‑RGD扩增引物：F2：5′CGCAACATATGCATCATCATCATCATCATAACAACGGTAACAACGGTCTCG3′Ndel/6xhisR2：5′AACTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACG3′Pstl以F2、R2为引物，pTWIN1‑IL10‑RGD为模板，随之按95℃ 10s预变性，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1.2min，30个循环后72℃进行延伸5min，得到PCR产物，产物及pTWIN1‑IL10‑RGD载体分别经Ndel/Pstl双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化Rosetta，挑取单克隆，抽提质粒，酶切鉴定，进一步经测序鉴定，构建成pTWIN1‑his‑IL10‑RGD表达载体的工程菌；3)rhIL‑10重组蛋白在大肠杆菌中的表达上述工程菌pTWIN1‑his‑IL10‑RGD/Rosetta接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，次日以1％的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素发酵培养基中，继续在37℃震荡培养至对数生长中期，培养液光密度OD600为0.6时，加入1mM IPTG继续培养5hr诱导表达，离心收集菌体；4)rhIL‑10蛋白表达的检测及鉴定将诱导表达的菌体培养物离心，收集菌体，采用12％的SDS‑PAGE电泳分析表达产物，IPTG诱导与未诱导样相比，在分子量相应处有一条明显的深染新生蛋白带，与预计融合蛋白的分子量大小相符；将蛋白从凝胶电转移至PVDF膜上，常规Western blot分析，ECL发光，可见一明显显色带，分子量一致，未诱导菌株，标准蛋白及表达菌中其它条带无阳性反应；rh‑IL10融合蛋白的纯化方法，包括以下步骤：1)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的粗提取诱导表达的菌体20g，用200ml裂解液：10mM Tris‑Cl，pH8.5；1mM EDTA，pH8.0，磁力搅拌器充分搅拌15min后，加入200μl的50μg/ml溶菌酶，充分搅拌15min，4℃静置1hr，取样50μl，12000rpm离心5min，上清中加入2×loading buffer混匀，沉淀中加入50μl ddH2O重悬，加入2xloading buffer混匀；废水煮5min，12000rpm离心5min，经SDS‑PAGE检测发现表达的融合蛋白存在于沉淀中，说明诱导表达的重组蛋白是以包涵体形式存在的；2)包涵体洗涤第一，加入0.1％单位为w/v的脱氧胆酸钠DOC，继续加入1mM MgCl2，加入2.5μg/ml DNA酶Dnase l，磁力搅拌器充分搅拌20min，取样50μl后静置10min，4℃离心，12000rpm/min，离心20min，弃上清；第二，加入200ml裂解液，0.5％单位为w/v的脱氧胆酸钠DOC进行洗涤，磁力搅拌器搅拌15min，取样50μl后静置10min，4℃离心，12000rpm/min，离心20min，弃上清；第三，加入200ml裂解液，0.5％单位为v/v Triton X‑100，磁力搅拌器搅拌15min，取样50μl后静置10min，4℃离心，12000rpm/min，离心20min，弃上清；第四，重复上一步操作；3)包涵体溶解第一，400ml溶解液溶解包涵体，磁力搅拌器搅拌1.5hr，4℃静置过夜；其中，溶解液为0.1M Tris‑Cl，pH 10.0，0.1M NaCl，8M尿素，10mM 2‑巯基乙醇；第二，将上述溶解液12000rpm离心20min，收集上清；第三，将上清装入透析袋，用pH8.0溶解液不含β‑ME透析24‑36hr，换液2‑3次，离心收集上清；4)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的纯化取GE公司镍柱基质NI Sepharose Fast Flow装柱，柱体积5.4×15cm，用pH8.0溶解液不含β‑ME平衡，上样后分别用含0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3M咪唑pH8.0溶解液线性梯度洗脱，收集各个峰样品，SDS‑PAGE鉴定；5)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的复性及自切割于4℃时，在复性缓冲液的逐渐稀释下缓慢复性，在pH6.0缓冲液中融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD发生自切割，透析至pH8.0缓冲液中；SDS‑PAGE跑胶鉴定；6)IL10‑RGD纯化0.1M pH为8.0的Tris‑ClpH8.0，0.1M NaCl缓冲液平衡柱，上样后缓冲液平衡柱后用含0.01、0.02、0.15、0.25M咪唑线性洗脱，收集各个峰样品，浓缩后SDS‑PAGE鉴定；银染结果证明样品纯度达95％以上，即为rhIL‑10‑RGD。