[发明专利]一种刀豆球蛋白A的测定方法

摘要

一种刀豆球蛋白A的测定方法，属于化学发光技术领域，本发明是基于刀豆蛋白A识别氨基葡萄糖修饰磁性微球和链式杂交反应原理测定刀豆蛋白A的方法。在目标物刀豆蛋白A存在时，标记有不同DNA链的磁性微球相互靠近，磁性微球表面修饰的DNA发生杂交反应，然后，再与修饰有异硫氰酸荧光素FITC的发卡DNAFITC‑H1和FITC‑H2进行杂交链式反应，利用光二极管诱导化学发光原理，根据化学发光强度，实现对刀豆蛋白A的测定。本发明测定方法简单、成本低、灵敏度高。

主权项

一种刀豆球蛋白A测定的方法，具体特征包括以下步骤：a.将发卡DNA1、发卡FITC‑H1和发卡FITC‑H2在使用之前孵化，然后，逐步降温至室温；b.取羧基化磁珠至小离心管中，并用Tris‑HCl缓冲溶液洗涤两遍，并分散到Tris‑HCl缓冲溶液中；c.将N‑(3‑(二甲基氨基丙基)‑N‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺加入步骤b中处理好的磁珠溶液中，将该混合物在室温下轻摇1h；d.将氨基化葡萄糖水溶液和DNA1加入步骤c所得溶液中，在4℃条件下，振动12h，反应完成后，将所得产物GA‑MB‑DNA1经过磁性分离，并用Tris‑HCl缓冲溶液洗涤两遍，再分散到Tris‑HCl缓冲溶液中；e.将氨基化葡萄糖水溶液和DNA2加入步骤c所得溶液中，在4℃条件下，振动12h，反应完成后，将所得产物GA‑MB‑DNA2经过磁性分离，并用Tris‑HCl缓冲溶液洗涤两遍，再分散到Tris‑HCl缓冲溶液中；f.将GA‑MB‑DNA1溶液和GA‑MB‑DNA2溶液混合，然后加入刀豆球蛋白A的样品溶液，在37℃下振荡反应30min，反应完全后，磁分离，并用磷酸缓冲溶液清洗两遍，并除去上清液；g.取含有FITC‑H1和FITC‑H2的磷酸缓冲溶液加入到步骤f所得溶液中，在37℃振荡反应1h，然后将磁珠用磷酸缓冲溶液清洗两遍，再将其分散于磷酸缓冲溶液中；h.取鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入步骤g所得磁珠溶液，打开光二极管电源，照射一段时间后关闭电源，然后测定化学发光强度，根据化学发光强度实现刀豆球蛋白A的测定；所述的DNA1、DNA2、FITC‑H1和FITC‑H2的部分序列如下：DNA1：5’‑GGATCCAACTCGCCAGGGTTAGCGTTTTTTCCCTGGCGAGTTGGATCCTGACA CTT TTTT‑3’；DNA2：5’‑AAAAAAGTGTCAGGATCCAACTCGCCAGGG‑3’；FITC‑H1：5’‑FITC‑AAAAAACGCTAACCTAGGTTGAGCGGTCCCAAAAAAGTGTCAGG GAC CGCTCAACCTAGG‑3’；FITC‑H2：5’‑GGATCCAACTCGCCAGGGTTAGCGTTTTTTCCCTGGCGAGTTGGATCCTG ACA CTTTTTT‑FITC‑3’。