[发明专利]一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法

摘要

本发明提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，该方法用丹参SmWRKY70转录因子构建重组的植物表达载体，遗传转化丹参叶片获得转SmWRKY70基因的丹参毛状根。本发明从丹参中分离克隆出789bp的SmWRKY70转录因子的编码框序列，并克隆了918bp的SmWRKY70转录因子的启动子序列；构建了SmWRKY70转录因子的亚细胞定位载体；构建了SmWRKY70基因的过表达载体，遗传转化丹参叶片获得SmWRKY70基因的过表达丹参毛状根。采用本发明的方法获得的转基因丹参毛状根中丹参酮含量显著提高，为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质药源，对缓解丹参酮药源的紧缺性起到积极的促进作用，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

主权项

一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因，分析其编码框序列，将丹参SmWRKY70转录因子基因插入植物表达载体，分别构建SmWRKY70基因的过表达载体；所述的丹参SmWRKY70转录因子基因序列如SEQ ID NO.1所示；(2)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列，所述丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列如SEQ ID NO.2所示；(3)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，设计QRT‑PCR引物，对丹参SmWRKY70转录因子进行组织表达谱分析和诱导响应分析；(4)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草，对丹参SmWRKY70转录因子进行亚细胞定位分析；(5)将步骤(1)所获得的SmWRKY70基因的过表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；(6)将步骤(5)所获得的含SmWRKY70转录因子的植物过表达载体的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根；所述的经PCR检测的阳性转基因丹参毛状根是指：在驱动插入基因SmWRKY70表达的组成型启动子CaMV35S的内部及插入基因SmWRKY70的内部，分别设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因丹参毛状根株系；(7)QRT‑PCR分析步骤(6)获得的经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根中SmWRKY70基因的表达，筛选出过表达SmWRKY70基因株系中SmWRKY70基因的表达量提高的株系；QRT‑PCT分析转基因丹参毛状根中SmWRKY70基因以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达，具体方法为：对经PCR鉴定为阳性的转基因丹参毛状根克隆进行总RNA的提取，并反转录成cDNA，分别设计检测基因及看家基因Actin的引物，进行QRT‑PCR扩增，分析SmWRKY70基因以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达情况；(8)用高效液相色谱法测定步骤(7)获得的过表达SmWRKY70基因株系中丹参酮的含量，筛选丹参酮含量提高的转基因丹参毛状根株系；对SmWRKY70基因的表达量显著提高的转基因丹参毛状根中丹参酮的含量进行高效液相色谱法测定的具体测定方法如下：将丹参酮粗提物各取20μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为C‑18反相硅胶柱，流动相为乙腈：水＝65：35，柱温为30℃，流速为1mL/min，检测波长为220nm。