[发明专利]一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法，该方法包括以下步骤：(1)DCN基因克隆；(2)过表达载体pEGFP-Cl/DCN的构建。该方法在克隆绒山羊DCN基因cDNA序列的基础上，构建过表达载体pEGFP-Cl/DCN，为后续研究绒山羊DCN基因功能奠定基础。

主权项

一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)DCN基因克隆绒山羊皮肤总RNA提取，cDNA第一条链的合成，设计引物DCN‑F、DCN‑R，以cDNA为模板，使用引物DCN‑F、DCN‑R和Phusion高保真DNA聚合酶，按常规方法进行PCR扩增；反应条件为：98℃5min；98℃30s、59℃2min、72℃2min，30个循环；72℃10min；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定；(2)过表达载体pEGFP‑Cl/DCN的构建利用限制性内切酶BamH I和EcoR I对纯化后的目的基因与真核表达载体pEGFP‑Cl同时进行双酶切，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；回收后的目的基因片段和经同样双酶切的表达载体pEGFP‑Cl进行连接；反应体系为：T4DNA连接酶1μL、pEGFP‑Cl纯化产物1μL、PCR产物3μL、dH2O 3μL、10×buffer1μL，16℃过夜连接；将连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，立即移入冰中静置5min，之后加入500μL37℃预温的无抗性LB培养基，37℃摇床培养1h，最后将菌液均匀涂布含有Kanamycin的LB固体培养基上，放入37℃生化培养箱内过夜培养，筛选阳性菌落；随机挑取15株单克隆菌落，用PCR法鉴定阳性克隆菌落；按照天根公司的质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒；用PCR法、单双酶切鉴定连接后将菌液送到Invitrogen公司测序；所得到的重组真核表达质粒命名为pEGFP‑Cl/DCN。