[发明专利]单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗及其制备方法，该疫苗由质粒pRSC‑NLDC145*gD‑IL‑21构成,采用纳米材料壳聚糖包裹；其中gD为单纯疱疹病毒I型的主要包膜糖蛋白之一，采用胞外区基因组，NLDC‑145是针对小鼠DEC‑205的单克隆抗体，IL‑21为免疫佐剂。该疫苗由HSV‑1gD；NLDC145基因的获取；pRSC‑NLDC145*gD‑IL‑21质粒的构建；制备壳聚糖/质粒DNA纳米疫苗等一系列步骤制备而成。本发明提供的单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗，能够安全有效地抵抗HSV‑1的感染，明显抑制了HSK的发生、发展，具有广阔的应用前景。

主权项

一种单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗，其特征在于：由质粒pRSC‑ NLDC145*gD‑IL‑21构成, 采用纳米材料壳聚糖包裹；其中：gD为单纯疱疹病毒I型的主要包膜糖蛋白之一，采用胞外区基因组 ，NLDC‑145是针对小鼠DEC‑205的单克隆抗体，IL‑21为免疫佐剂；质粒pRSC‑NLDC145*gD‑IL‑21的浓度为5 µg/µl；通过以下步骤制备得到：（1）HSV‑1 gD；NLDC145基因的获取；具体包括：（1a）细胞和病毒的培养；（1a‑1）RPMI 1640培养基的制备；（1a‑2）细胞培养：将绿猴肾传代细胞复苏后传代；（1a‑3）病毒的培养：接种HSV‑1病毒悬液于Vero细胞中，培养基为胎牛血清体积含量为10%的RPMI 1640，收获感染病毒的细胞，并离心，其上清含有病毒，TCID50滴定后‑70℃保存备用；细胞沉淀用于HSV‑1基因组DNA的提取；（1b）HSV‑1基因组DNA的提取；具体包括：设计引物，PCR扩增获得gD基因；（1c）PCR扩增gD基因；NLDC145的全基因人工合成；（1d）NLDC145，gD基因的检测与凝胶回收；（2）pRSC‑NLDC145*gD‑IL‑21质粒的构建；具体包括：（2a）构建pRSC‑gD‑IL‑21 质粒；（2b）构建原gD酶切的pRSC‑NLDC145‑IL‑21质粒；（2c）构建pRSC‑NLDC145*gD‑IL‑21 融合表达质粒；其中，步骤（2a）构建pRSC‑gD‑IL‑21 质粒；（2b）构建原gD酶切的pRSC‑ NLDC145‑IL‑21质粒的步骤包括：（2ab‑1）制备LB培养基；（2ab‑2）酶切、连接获得pRSC‑gD‑IL‑21 质粒并筛选鉴定；（2ab‑3）将全基因合成的NLDC145片段和pRSC‑gD‑IL‑21分别进行酶切反应，回收纯化，鉴定后，以紫外分光光度计定量两种双酶切产物的量；（2ab‑4）质粒和目的基因片段的连接：将上述的NLDC145片段和原gD已酶切的质粒pRSC‑IL‑21进行连接反应；（2ab‑5）制备新鲜感受态细菌及转化：接种Ecoli DH5α单菌落于LB培养基，于37 oC，转速250 rpm培养过夜；转种过夜培养菌液于LB培养基，37℃培养至细菌密度OD 600为0.4，取菌液至离心管，于4 oC，转速4000 rpm，离心10 min，弃上清；加75 mM CaCl2混匀，冰浴30 min；于4 oC，转速4000 rpm，离心10 min，弃上清；加75 mM CaCl2重新混匀，此即为新鲜的感受态细菌；另取离心管，加连接反应液，再加新鲜感受态细菌，混匀，冰浴30 min；42 oC水浴100 s，再冰浴2 min；加LB培养基，37 oC 1 h后，取涂布于含100 µg/ml Amp的LB平皿，37 oC培养过夜；（2ab‑6）重组质粒PCR鉴定：在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行PCR鉴定 ，所得产物以1.2% 琼脂糖电泳检测；（2ab‑7）重组质粒酶切鉴定：上述PCR产物阳性之克隆移入LK液体培养基中，于37℃恒温振荡细菌摇床中250 rpm培养12小时，抽取质粒后，进行酶切反应，分别取 DNA Marker、酶切产物后，100v电压电泳30 min后观察结果；步骤（2c）包括：（2c‑1）酶切反应：将纯化的gD基因PCR产物片段和质粒pRSC‑NLDC145‑IL‑21分别进行酶切反应；（2c‑2）连接反应：将上述的酶切产物gD DNA片段和质粒pRSC‑NLDC145‑IL‑21按进行连接反应；（2c‑3）制备新鲜感受态Ecoli DH5α细菌及转化；（2c‑4）PCR鉴定：在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行PCR鉴定 ，所得产物以1.2% 琼脂糖电泳检测；（2c‑5）重组质粒的酶切鉴定 ：上述PCR产物阳性之克隆按设计好的反应体系进行酶切反应，分别取 DNA Marker、酶切产物，100v电压电泳30 min后观察结果；（2c‑6）阳性克隆测序；（3）制备壳聚糖/质粒DNA纳米疫苗，具体步骤为：（3a）配制5 mM NaAc缓冲液，且pH5.5，并用其将壳聚糖配成0.02%w/v浓度的溶液；（3b）将质粒DNA溶液用5mMNa2SO4溶液稀释；（3c）将壳聚糖溶液和质粒溶液分别55℃水浴10 min，将两种溶液等体积相混合于一个指形管中，在涡旋震荡器上震荡混匀。