[发明专利]小花矮牵牛原生质体的制备方法

摘要

本发明公开了一种小花矮牵牛原生质体的制备方法；该方法包括以下步骤：在黑暗条件下，将幼嫩叶片置于3～5℃清水中预处理20～25h；用酶解液酶解预处理后的叶片；加入和酶解液等体积的CPW洗液，摇匀，300目细胞筛过滤，转速1100r/min离心2min，吸去上清液；向沉淀中加入CPW洗液洗涤原生质体，转速1100r/min离心2min，收集沉淀加入悬浮液悬浮，即得到产量为(5.0±0.3)×10⁶个/g，活性达到85％的原生质体，9h后80％的原生质体可维持活性。用本发明的分离方法获得了高活性、高产量及状态良好的原生质体，可满足原生质体的培养及植株再生的条件，为植物原生质体融合培育新品种提供实验材料。

主权项

1.一种小花矮牵牛原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：A、在黑暗条件下，将小花矮牵牛的幼嫩叶片置于3～5℃清水中预处理20～25h；B、用酶解液酶解步骤A处理后的叶片；所述酶解液的溶剂为0.25M的磷酸盐溶液，溶质为如下终浓度的物质：2wt％的纤维素酶、0.8wt％离析酶、0.2wt％果胶酶、0.11wt％无水氯化钙、0.10wt％牛血清白蛋白；所述酶解液的pH为5.6～5.7；C、向步骤B酶解结束后的溶液中加入和所述酶解液等体积的CPW洗液，摇晃酶解液，经300目细胞筛过滤后1100r/min离心2min，吸去上清液；所述CPW洗液中溶剂为CPW盐溶液，溶质为终浓度0.25M的甘露醇；D、再次加入CPW洗液洗涤，1100r/min离心2min，吸去上清液，收集沉淀，即得原生质体；E、在所述原生质体中加入悬浮液，分离得到悬浮纯化后的原生质体；所述悬浮液为含0.25M的甘露醇、4mM MES、0.1wt％KCl的水溶液，所述悬浮液的pH为5.6～5.7；所述酶解温度为25～27℃，酶解时间为5h。