[发明专利]一种己二酸的全生物合成方法

摘要

本发明公开了一种己二酸的全生物合成方法，其包括，对褐色嗜热裂孢菌进行代谢改造，获得能够产己二酸的突变菌株B6；确认己二酸的合成途径，将该途径的基因导入大肠杆菌中模块化表达，并且平衡异源代谢途径的表达；调节异源基因的表达量和不同模块的流量比，提高己二酸的积累。本发明己二酸及其前体物的生物制造具有污染少、产品质量高等优点，极具发展前景。

主权项

1.一种己二酸的全生物合成方法，其特征在于：包括，对褐色嗜热裂孢菌进行代谢改造，获得能够产己二酸的突变菌株B6；确认己二酸的合成途径，将该途径的基因导入大肠杆菌中模块化表达，并且平衡异源代谢途径的表达，所述己二酸的合成途径为3‑氧代己二酰辅酶A途径，所述3‑氧代己二酰辅酶A途径中共有5步反应，四个酶，四种酶分别对应的基因为β‑酮硫解酶基因，3‑羟酰基‑辅酶A脱氢酶基因，3‑羟基己二酰脱氢酶基因和5‑羧基‑2‑戊烯酰辅酶A还原酶基因,所述3‑氧代己二酰辅酶A途径在大肠杆菌中模块化构建，将3‑氧代己二酰辅酶A途径的6个基因被分成两个模块导入大肠杆菌表达，其中5步代谢步骤中的四个酶的基因，经过密码子优化后，放入一个操纵子内，然后连接至pACYCDuetTM‑1，形成上游模块，将该代谢步骤的限制性步骤的酶琥珀酰辅酶A合成酶的基因Tfu_2577，2576经过密码子优化后连接到pETDuetTM‑1，形成下游模块；调节异源基因的表达量和不同模块的流量比，提高己二酸的积累，平衡上游模块中异源基因表达，提高己二酸前体‑己二酰辅酶A的供给，包括，1)通过代谢通量分析，预测己二酰辅酶A步骤中不同基因表达量配比，2)通过增加RNA发卡结构，构建不同稳定性的目的基因mRNA二级结构，平衡异源基因的表达，基于启动子工程，最优化上游模块和下游模块的表达量,包括，使用来自噬菌体的组成型启动子PL‑λ，以该启动子为模板进行易错PCR，获得突变序列，将突变库中的启动子替换连接到pGLO质粒中的绿色荧光蛋白基因上游，并且将上述质粒库导入大肠杆菌中形成GLO‑PL‑λ质粒库，将大肠杆菌培养到对数期，利用流式细胞仪,选择荧光强度最弱，中等，最强的三种突变启动子，分别将上述PL‑λ的三种突变启动子，取代上游模块和下游模块的启动子，将不同组合的两种质粒导入大肠杆菌中表达，选择具有最佳己二酸生产性能的质粒组合，基于代谢模型理性调节影响己二酸积累的代谢途径。