[发明专利]一种重组人胰岛素的工业制备方法

摘要

本发明公开了一种重组人胰岛素的工业制备方法，包括以下步骤：步骤S100：制备菌种；步骤S200：培养菌种；步骤S300：包涵体的收集；步骤S400：RRhPI初步纯化；步骤S500：RRhPI重组复性；步骤S600：酶切转化；步骤S700：hI的纯化；步骤S800：hI成品。本发明简化工艺流程，提高生产效率，改进产品品质，适应工业制备需求。

主权项

一种重组人胰岛素的工业制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S100：制备菌种；步骤S200：培养菌种；步骤S300：包涵体的收集；将培养的菌种在‑20℃以下冻干，然后用缓冲液A溶解，室温状态下振荡2‑4h，固液分离后收集沉淀，得包涵体；步骤S400：RRhPI初步纯化；将收集的包涵体用缓冲液B完全溶解后，再以缓冲液B与缓冲液C体积比为1:2‑1:10添加缓冲液C，使蛋白浓度为0.05‑0.5mg/ml，然后上于已用缓冲液B平衡的DEAE‑Sepharose FF柱，用NaCl梯度洗脱，收集含RRhPI的洗脱液；步骤S500：RRhPI重组复性；初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G‑25脱尿素，再转换到缓冲液D中，4℃放置18h以上，得RRhPI复性液；步骤S600：酶切转化；按胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白的质量比为2:1:2000，向RRhPI复性液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B，室温酶切50‑80min，然后用0.1mol/L ZnCl₂ 终止反应并沉淀生成hI；步骤S700：hI的纯化；hI的纯化包括粗纯化和精纯化；所述粗纯化时，将步骤S600中的hI通过预置8‑12mmol/L的Tris‑HCl和0‑1.0mmol/L的NaCl的两步柱层析，对hI进行初步提纯得到粗品；所述精纯化时，用10‑20mmol/L的色谱乙腈对粗品进行精制得到精品；步骤S800：hI成品；精品再经多次结晶和水洗后进入过滤除菌室，‑20℃以下冻干，得到hI成品；所述步骤S100具体是指：步骤S110：以人胰腺cDNA文库为模板，用PCR扩增技术提取目的基因；步骤S120：从用细胞工程培养的大肠杆菌中通过碱裂解法提取环装的pQE‑40质粒；步骤S130：分别取出目的基因和pQE‑40质粒，分别利用限制性内切酶Bam HI和Hind III同时酶切并产生粘性末端；步骤S140：在20℃以下，T₄DNA连接酶的作用下，将目的基因与pQE‑40质粒结合通过粘性末端互补，形成一个能表达胰岛素的重组DNA；步骤S150：将含有目的基因的重组DNA放入大肠杆菌的培养液中并加入氯化钙，使大肠杆菌将重组DNA吸收，重组DNA转化E.coli感受态细胞M15；所述步骤S200具体是指：步骤S210：取出步骤S100中制备的菌种进行活化；步骤S220：采用二级发酵方式，恒温振荡2‑3h；步骤S230：用0.5mmol/L的IPTG诱导RRhPI/pQE40 E.coli M15菌种表达RRhPI。