[发明专利]以淀粉为原料制备葡萄糖‑1‑磷酸的方法

摘要

本发明公开了一种以淀粉为原料制备葡萄糖‑1‑磷酸的方法，包括如下步骤(1)将编码葡聚糖磷酸化酶的基因经稀有密码子优化后连接到pET‑28a(+)质粒上，构建重组质粒pET‑28a‑GP，再转化到E.coliBL21(DE3)中，构建重组菌，诱导表达所得重组菌；(2)将诱导表达后的重组菌离心、收集菌菌体，制备重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液；(3)将所得重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液加入淀粉与缓冲液的混合溶液中，75‑90℃下反应，得葡萄糖‑1‑磷酸。采用本发明方法，底物转化率可达67.6％。本发明的特点在于直接利用普通淀粉，与现有的G‑1‑P生产方法相比，本发明使用普通淀粉为原料，大幅降低G‑1‑P生产的原料成本，为G‑1‑P的工业化生产奠定基础。

主权项

一种以淀粉为原料制备葡萄糖‑1‑磷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将编码葡聚糖磷酸化酶的基因经稀有密码子优化后连接到质粒上构建重组质粒，再将重组质粒转化到宿主菌中构建重组菌；诱导表达所得重组菌；所述编码葡聚糖磷酸化酶的基因来源于最适温度为75℃及以上极端嗜热菌；编码葡聚糖磷酸化酶的基因经稀有密码子优化后的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；诱导表达重组菌时的诱导条件为：在37℃下培养2‑4.5h，然后加入诱导剂，25‑37℃继续培养6‑10小时；(2)将诱导表达后的重组菌离心、收集菌体，将收集到的菌体破胞得粗酶液，将所得粗酶液在85‑90℃保温20‑40min使宿主菌中蛋白失活沉淀，然后离心、其沉淀，所得上清液即为重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液；(3)将所得重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液加入淀粉与缓冲液的混合溶液中，85‑90℃下反应20‑50小时，得葡萄糖‑1‑磷酸；所述淀粉为木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉或小麦淀粉；在加入重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液前将淀粉与缓冲液的混合溶液在95‑105℃下保温1.5‑2.5h；所加重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液的终浓度为4500‑5500U/L；淀粉与缓冲液的混合溶液中淀粉的质量浓度为5‑10％，混合溶液中的淀粉分两次投加，一部分反应开始时投加，余下部分反应中补加。