[发明专利]一株表达赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建及表达方法

摘要

本发明提供一株表达赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建及表达方法，属于生物工程技术领域。本发明将来源于铜绿假单胞菌NJ-814（已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.7638）的赖氨酸氨肽酶基因整合到毕赤酵母染色体上，获得重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-PLAP，用该菌表达赖氨酸氨肽酶。

主权项

一种胞外分泌表达来源于铜绿假单胞菌NJ‑814赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于将来源于铜绿假单胞菌NJ‑814的赖氨酸氨肽酶基因PLAP导入到毕赤酵母GS115中得到的基因工程菌，简称为重组毕赤酵母GS115/pPIC9K‑PLAP；步骤为：（1）用赖氨酸氨肽酶基因序列设计一对引物P1、P2，以铜绿假单胞菌NJ‑814基因组为模板，P1、P2为引物扩增目的基因；上游引物P1：5＇‑CCGGAATTCA TGGGCAAACC CTAACCC‑ 3＇，下划线表示EcoRΙ酶切位点；下游引物P2：5＇‑TCCCCTAGGT TACTTGATGA AGTCGTGACC CC‑ 3＇，下划线表示AvrⅡ酶切位点；（2）将目的基因连接到表达载体pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K‑PLAP，转化E.coli JM109，涂布于含氨苄抗性的LB固体平板上，菌落PCR扩增目的基因、双酶切进行验证阳性转化子，验证正确的重组载体pPIC9K‑PLAP送去测序；（3）测序正确的重组载体pPIC9K‑PLAP用Bgl II进行单酶切，经酶切线性化之后，同毕赤酵母感受态细胞混匀，进行电击转化，参数设置1500 V，400Ω，25/50 μF，4‑6 ms；将电转液涂布于MD平板，待菌长出来以后分别点接于MM及MD平板，获取重组毕赤酵母GS115/pPIC9K‑PLAP；（4）筛选获得重组菌，进行表达验证。