[发明专利]一种实时观测枯草芽孢杆菌生物膜生长过程中不同基因表现型细胞和分布的方法

摘要

本发明提出一种实时观测枯草芽孢杆菌生物膜生长过程中不同基因表现型细胞数量和分布的方法，包括步骤首先采用三色荧光标记的枯草芽孢杆菌菌种，三种荧光标记颜色分别对应生物膜生长过程中三种主要的细胞基因表现型细胞；将一定数量的细胞培养溶液嫁接到特定化学成分的琼脂培养基上，采用立体显微镜及相应的滤波片和红外透射光，观测随着生物膜的生长不同基因表现细胞在生物膜中的分布特点及其厚度变化，并对图片校准分析得到每一种基因表现型细胞的数量，及它们之间的转化率以及细菌生物膜生长的几何参数。该方法实现了在不破坏生物膜的情况下对生物膜生长过程的实时观测，同时得到不同基因表现型细胞的数量以及分布区域。

主权项

实时观测枯草芽孢杆菌生物膜生长过程中不同基因表现型细胞数量和分布的方法，包括以下步骤：（1）三色荧光标记枯草杆菌细菌菌种；包括采用基因转导技术，在三种不同基因表现型细胞对应的DNA的启动基因上融合上能够编译特定荧光蛋白的基因；制得的枯草杆菌菌种储存在零下80度的冰柜中备用；三种荧光蛋白同时标记到一个细胞的 DNA，使得每一个细胞标记有三种荧光蛋白和荧光蛋白启动蛋白，当生物膜生长到不同的阶段相应的启动蛋白被激活， 对应的的荧光蛋白就会呈现相应颜色；（2）制备Luria‑Bertani细菌培养溶液：采用步骤1中制备的枯草杆菌菌种，采用如下方式培养细菌菌种：从冰箱中取出的菌种，放入3毫升Luria‑Bertani 溶液在37度情况下放在持续晃动的恒温箱中培养；采用Luria‑Bertani 溶液培养步骤1制得的三色荧光标记菌种在培养箱中培养一定时间，采用细胞密度测量仪，直至把细胞培养到OD600=1备用；（3）制备细菌生物膜生长的基底：生长细菌生物膜的基底材料是含有1.5克/毫升的琼脂的培养生物膜的溶液，将其消毒杀菌后注入培养皿中盖上盖子进行室温冷却，备用；（4）把步骤（2）得到的三色荧光标记的菌种溶液嫁接到步骤（3）中得到的培养皿表面上；控制培养基底的厚度和细菌细胞的嫁接量使得生物膜上的细胞能够在两天内经历三种主要的基因表现型；（5）实验观测细菌生物膜生长的装置装备搭建：在显微镜进行两天的生物膜生长拍摄过程中，将步骤4制备的培养皿放置在塑料容器中，用蒸馏水浸湿的纸巾用来保持内部的湿度，并在容器的底部设置适当大小的孔使红外透射光直接穿过培养皿，以消除塑料容器壁对测量结果的影响；所述孔的直径大于拍摄过程中最终生物膜的直径；同时将容器用塑料包膜密封到荧光显微镜的镜头上，用来实时拍摄生物膜的生长演化过程；拍摄过程中；在生物膜生长的过程中，温度保持在32摄氏度；（6）用于拍摄三色荧光标记细胞菌种生物膜生长的宽场荧光立体显微镜的搭建：使用Zeiss Lumar立体显微镜用来拍摄生物膜的生长；采用Schott KL LCD halogen灯作为透射光通道照明装置，采用0.8x镜头能够使拍摄的视野范围达到2.3cm ×2.3cm,观测整个生物膜的生长；同时采用三个不同的滤波装置观测荧光通道的强度，每一个滤波装置包含一个激发特定荧光团的波段和一个发射特定荧光团的波段，1）CFP滤波装置激发波段436nm,发射波段480nm,2）RFP滤波装置激发波段555nm,发射波段585nm，3）YFP滤波装置激发波段500nm,发射波段535nm；所有的图片进行保存；图片的分辨率是12微米/pixel；（7）对每个荧光通道的滤波装置进行实验验证：通过单色荧光标记的细菌细胞对步骤（6）荧光通道的滤波装置进行验证，单色荧光标记方法如步骤（1）所述，通过验证，每个荧光通道的发射波长无重叠现象；（8）透射光通道的校准方法：通过对生物膜截面透射光通道的图片进行校准得到生物膜的厚度演化；通过设置一个门槛值 OD=0.02，来界定生物膜的边界，从而得到生物膜的厚度与光强度的关系，定量得到光强OD和厚度h之间的关系系数 λ，λ表示衰减长度 ；h、λ的单位为毫米；OD = h / λ                      (1)（9）荧光通道的校准方法：通过对荧光通道的校准得到生物膜生长过程中三种基因表现型细胞的分布；假设总的细胞个数等于三个通道的细胞的数量的总和，因此由步骤（8）得到的生物膜的厚度通过三种基因表现型细胞的厚度的相加得到，如公式（2）所示；而总细胞个数与生物膜厚度之间的关系如公式（3）所示；Ncell(r; t) = CredIred(r; t) + CblueIblue(r; t) +CgreenIgreen(r; t):      (2)h(r; t) = C0Ncell(r; t):                   (3)由以上公式，分析不同时刻的生物膜的厚度即得到C0、Cred、Cblue和Cgreen的平均值；其中，Ncell代表总细胞个数，t代表时间，r代表半径，Ired代表运动型细胞通道荧光强度，Iblue代表分泌基质型细胞通道荧光强度，Igreen代表孢子型细胞通道荧光强度，Cred代表运动型细胞通道荧光强度系数，Cblue代表分泌基质型细胞通道荧光强度系数，Cgreen代表孢子型细胞通道荧光强度系数，C0代表总细胞个数与生物膜厚度之间的比例关系， h代表生物膜高度，单位是毫米；由以上公式，我们分析不同时刻的生物膜的厚度即得到C0、Cred、Cblue和Cgreen的平均值;通过以上分析即得到三种荧光标记的细胞类型分别占总细胞数量的百分含量，以及每种细胞类型占总厚度的比例；进一步得到不同的基因表现型细胞对应的随时间变化的厚度曲线、不同时间不同基因表现型细胞所占的含量、不同时间不同基因表现型细胞的数量和空间分布、不同时间三种基因表现型细胞之间的转化率。