[发明专利]蟹壳下脚料抗氧化肽链的制备方法

摘要

本发明公开了一种蟹壳下脚料抗氧化肽链的制备方法，通过脱脂、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶双酶酶解制备酶解液，酶解液采用超滤、大孔树脂纯化、阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽链Ile‑Trp‑Met‑Glu‑Cys‑Asn‑Trp，ESI‑MS测定分子量为979.15 Da。本发明制备的抗氧化肽链对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Ile‑Trp‑Met‑Glu‑Cys‑Asn‑Trp亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。

主权项

蟹壳下脚料抗氧化肽链的制备方法，其特征在于包括下述步骤：1）蟹壳下脚料预处理：取过100目筛的蟹壳下脚料，按照料液比1g: 5 ~10mL加入异丙醇，于40~50℃脱脂8~10 h，然后于8000~10000 rpm离心10~15 min除去异丙醇，收集脱脂蟹壳下脚料固形物；2）蟹壳下脚料的酶解：将上述脱脂蟹壳下脚料固形物按固液比1g:10~15mL加入磷酸盐缓冲液，混合液温度升至45~50℃、超声处理10~15 min；然后按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的1.0~1.5%加入中性蛋白酶，在45~50℃酶解4~6 h；将酶解液升温至90~95℃后恒温保持10~15 min，酶解液温度降至50~60℃，按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的2.0~2.5%加入木瓜蛋白酶，在50~60℃酶解4~6 h，冷却至室温，于9000~10000 rpm离心10~15min，除去沉淀物，得到酶解液；步骤2）磷酸盐缓冲液为0.05 mol/L，pH 6.5~7.5；3）蟹壳下脚料抗氧化肽链的制备：将步骤2）制备得到的上述酶解液采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得到超滤酶解液；将超滤酶解液按照体积比加入到装有6～8倍DA201‑C大孔树脂的层析柱中，用4～5倍柱体积双蒸水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的70%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得到蟹壳下脚料抗氧化肽链。