[发明专利]基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法

摘要

本案涉及基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法将电极浸入第一DNA片段分子溶液，在37℃下反应6h，再浸入巯基己醇溶液反应1h；再浸入银纳米颗粒溶液中反应1h，再浸入第二DNA片段分子的溶液中反应0.5h；配制microRNA标准液；再浸入microRNA标准液，加入第三DNA片段分子、Klenow片段和dNTPs，在37℃下反应1h；再浸入Nt.BbvCI溶液中反应1h；采用线性扫描伏安法检测，绘制标准曲线图；按上述方法得到待测液的电信号，通过与标准曲线图进行比对，得到待测液中microRNA的浓度。本案具有操作简单，灵敏度高，特异性强，背景信号低，适用范围广等优点。

主权项

一种用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，包括以下步骤：步骤1)将电极浸入含0.1μM的第一DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应6小时，随后将电极浸入含0.1M的巯基己醇的溶液中，在37℃下反应1小时；其中，所述第一DNA片段分子含有至少一个巯基和一个氨基；步骤2)将经步骤1)修饰后的电极浸入含饱和银纳米颗粒的溶液中，在37℃下反应1小时，随后将电极浸入含1μM的第二DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应0.5小时；其中，所述第二DNA片段分子能够与所述第一DNA片段分子进行碱基互补配对；步骤3)分别配制至少四种不同浓度的microRNA标准液；步骤4)将经步骤1)和2)修饰后的电极浸入microRNA标准液中，加入1μM的第三DNA片段分子、5单位的Klenow片段和5nmol的dNTPs，在37℃下反应1小时；所述第二DNA片段分子能够与游离态的microRNA发生反应形成杂交体，所述第三DNA片段分子能够通过链置换反应将microRNA从该杂交体中再次解离出来，使microRNA回到游离态，起始新一轮的杂交与链置换反应；步骤5)将经步骤4)反应后的电极浸入100μL浓度为0.5unit/μL的Nt.BbvCI溶液中，在37℃下反应1小时；步骤6)取出经步骤5)反应后的电极，将其作为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极、铂丝电极为对电极、0.1M的氯化钾溶液为电解液，采用线性扫描伏安法进行检测，将得到的电信号与microRNA标准液的浓度关系绘制成标准曲线图；步骤7)将经步骤1)和2)修饰后的电极浸入待测液中，按步骤4)～6)的方法得到待测液的电信号，通过与标准曲线图进行比对，得到待测液中microRNA的浓度。