[发明专利]一种镉-IgM螯合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种镉‑IgM螯合物及其制备方法和应用，该镉‑IgM螯合物是镉离子与IgM通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。本发明建立了镉‑IgM螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测镉‑IgM螯合物在评价一个地区镉污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镉‑IgM螯合物可以间接反映这个地区人群受镉污染的情况，从而间接反映这个地区镉污染程度。本发明建立的镉‑IgM螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。

主权项

1.一种镉‑IgM螯合物，其特征在于，镉离子与IgM通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成；镉‑IgM螯合物的制备方法，包括以下步骤：A）镉与IgM的螯合反应：在人源的的IgM或按照生物学方法重组的IgM中加入镉离子进行螯合反应，得到反应溶液；所述步骤A）具体如下：1）透析袋的处理：将透析袋放入500mL体积的5mmol/L EDTA+200mmol/L NaHCO3溶液中，煮沸10min；倾弃EDTA/NaHCO3液，用超纯水轻轻漂洗，再用500mL 5mmol/L EDTA煮沸10min；弃掉煮沸液，彻底用超纯水清洗，加入大量的超纯水浸泡透析袋4℃过夜；使用时，戴上手套，取出透析袋，用大量的超纯水彻底冲洗其内外表面；2）取2.0mg ITCBE溶于2mL DMSO中；3）取4.0mg IgM溶于4.0mL 0.01M pH9.0的硼酸盐缓冲溶液中；4）缓慢将步骤2制备的液体加入IgM溶液中，边滴加边震荡，于25℃，100r/min的摇床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未与IgM结合的ITCBE；5）将透析所得的液体用1mol/L HCl调节pH值至7.0，然后缓慢逐渐滴加80μl 1mmol/L 镉离子溶液，边滴加边振荡，以免镉离子使蛋白变性沉淀；6）将加好的溶液在25℃，100r/min的摇床中反应2h，用处理好的透析袋进行透析24h；7）将透析后的液体于‑20℃分装保存；B）纯化镉‑IgM螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的IgM以及多余的镉离子，即得镉‑IgM螯合物；所述步骤B）具体如下：（1）溶解样品：向经过步骤A）得到的反应溶液中加入生理盐水，使镉‑IgM螯合物复溶；（2）平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgM特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；（3）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1）中样品，然后上柱，IgM与填料特异性结合；（4）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05‑0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱；（5）收集：收集经过步骤（4）洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；（6）透析：将步骤（5）中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；（7）平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与镉特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；（8）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6）中样本，然后上柱；（9）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5‑1.0mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱；（10）收集：收集经过步骤（9）洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；（11）透析：将步骤（10）中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得镉‑IgM螯合物。