[发明专利]用EMS诱导‘Hort16A’后代优株变异及AFLP检测方法

摘要

用EMS诱导‘Hort 16A’后代优株变异及AFLP检测方法，涉及猕猴桃育种及鉴定方法。本发明将EMS直接加入培养基的方法对猕猴桃进行诱导，其中0.08mg/L浓度对胚性愈伤组织的诱导效果较为显著。在AFLP中研究了PCR扩增所需酶用量、酶切时间和酶活性对酶切的影响；分析了酶活性和能量对连接引物的影响；在选择性扩增体系中筛选出适当的引物组合作为DNA预扩增后选择性扩增的引物，方便选择扩增多态性DNA和提高反映其片断长度多态性的可靠性，可达到一次检测诱导产生的突变体DNA水平的微小差异的目的。

主权项

一种用AFLP检测EMS诱导‘Hort 16A’后代变异的方法，包括以下步骤：（1）猕猴桃总DNA的提取及电泳检测：提取猕猴桃DNA，取DNA溶液5μL用1.0%琼脂糖凝胶电泳后检测DNA的纯度及浓度；（2）猕猴桃AFLP酶切反应中，采用20μl体系：300ng DNA，1 U EcoRI/MseI，4μl Buffer，其余为ddH2O；反应程序为37℃酶切4 h；65℃，20min；4℃，保存；（3）在猕猴桃AFLP连接反应中，采用20ul反应体系：5μl DNA酶切产物，2μl T4 buffer，2 U T4 DNA连接酶，1μl 接头引物，2μl ATP ，其余为ddH2O；连接程序为：22℃，过夜；65℃，10min ；4℃保存；（4）在猕猴桃AFLP预扩增体系中，采用25μl反应体系：2μl 连接产物，0.125μl Taq酶，0.5μl dNTPs，2.5μl buffer，1μl 预扩增引物，包括EcoRI Pre: 5' GAC TGC GTA CCA ATT CA 3'和MseI Pre: 5' GAT GAG TCC TGA GTA AC 3'，浓度为50ng/μl，其余为ddH2O；将配好的预扩增体系放入PCR仪中，反应参数为：94℃、90s，94℃、30s，56℃、1min，72℃、1min，各30循环；72℃，10min， ‑20℃保存备用；（5）在猕猴桃选择性扩增体系中，采用25μl反应体系：1:10稀释的2μl 预扩增产物，1μl EcoR I选择性扩增引物，1μl Mse I选择性扩增引物，0.5μl dNTPs，2.5μl buffer，0.25μl Taq酶，其余为ddH2O；所述选择性扩增引物由E‑ACG+M‑CTG、E‑ACG+M‑CAG、E‑AAG+M‑CAA、E‑AAG+M‑CTG、E‑ACT+M‑CAG、E‑ACG+M‑CAA、E‑AGG+M‑CAG和E‑AGG+M‑CAT共8对引物所组合；反应程序为：94℃、2min，94℃、30s，65℃、30s，72℃、80s，各14循环，退火温度每循环递减0.7℃；94℃、30s，55℃、30s，72℃、80s，各23循环；72℃，5min；（6）分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术分离和显示AFLP的扩增产物。