[发明专利]一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法

摘要

本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌及其提高精氨酸产量的方法，所述谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌的dtsR1基因被敲除，本发明将dtsR1基因敲除后，使其调控的α-酮戊二酸脱氢酶复合物(oxoglutarate dehydrogenase complex，ODHC)的转录水平大幅下降，使α-酮戊二酸流向了精氨酸；同时在发酵培养基中添加吐温80或油酸或二者混合物弥补了dtsR1缺失造成的营养缺失，在发酵培养对数生长初期添加吐温40诱导了磷酸戊糖途径的基因转录水平大幅提高，从而为精氨酸的合成提供了足量的NADPH，省去了采用其他繁琐的分子育种手段来提高NADPH供应及提高三羧酸循环途径中α-酮戊二酸的其他积累方法。

主权项

一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法，其特征在于，(1)dtsR1基因敲除同源臂的构建及敲除质粒的构建：设计敲除谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌dtsR1基因的上下同源臂引物并分别在上下臂引物的5‘端和3’端加上HindIII和XbaI限制性内切酶位点，分别通过PCR技术扩增dtsR1的上下同源臂，采用DNA纯化试剂盒纯化dtsR1的上下同源臂，并等摩尔混合后进行重叠PCR获得dtsR1基因敲除同源臂；通过HindIII和XbaI双酶切，将dtsR1基因敲除同源臂克隆至蔗糖致死质粒pK18mobsacB中，获得敲除质粒pK18mobsacB‑ΔdtsR1，并将其分别电转至谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌；(2)诱导敲除了dtsR1基因的谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌高产精氨酸：先在28～30℃种子培养基中活化谷氨酸棒杆菌或钝齿棒杆菌，培养14～16h后以1％～2％v/v的接种量接种至发酵培养基中，在28～30℃发酵生长至对数生长初期加入1mg/mL～15mg/mL吐温40或吐温80诱导高产精氨酸，其中种子培养基配方如下：葡萄糖30g/L，玉米浆25g/L，硫酸铵45g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，尿素1.5g/L，pH＝7.2；发酵培养基配方如下：葡萄糖120g/L，玉米浆25g/L，硫酸铵45g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，并加入了0.5g/L～2.0g/L油酸或吐温80或二者混合物，如摇瓶发酵则需加30g/L CaCO₃；(3)高密度发酵：对谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌重组菌进行高密度发酵，前期菌体生长阶段的参数为温度28～30℃，溶氧控制在18～22％的饱和溶氧浓度，pH为6.5～7.5；待OD₆₀₀至5‑6时，加吐温40诱导，溶氧控制在28～32％左右的饱和溶氧浓度，pH6.5～7.5，继续培养70～108h收集菌液。