[发明专利]一种小麦果聚糖代谢酶基因定量检测的方法

摘要

本发明公开一种小麦果聚糖代谢酶基因定量检测的方法，涉及小麦茎秆果聚糖代谢酶基因的实时荧光定量PCR技术定量检测技术，属于植物分子生物技术和基因工程领域。本发明利用小麦茎秆果聚糖代谢合成关键酶蔗糖：果聚糖-6-果糖基转移酶基因和降解关键酶基因果聚糖外水解酶基因，对6-SFT和FEH基因的表达量进行检测得到干旱调控小麦灌浆期茎秆果聚糖代谢分子生理调控机制。本发明的有益效果在于：本方法能够快速、准确的定量检测小麦灌浆期茎秆果聚糖代谢关键酶基因6-SFT和FEH的差异表达。

主权项

一种小麦果聚糖代谢酶基因定量检测的方法，其特征在于：小麦灌浆期茎秆总RNA提取、6‑SFT和FEH基因特异性引物设计与合成、制备反转录产物cDNA、qRT‑PCR检测以及基因相对表达量的计算；所述小麦灌浆期茎秆总RNA提取，方法如下：1)将小麦茎秆浸入液氮，快速剪切小麦茎秆呈1～2cm长的碎片，充分混匀碎片，称取小麦组织0.2g茎秆碎片，加入2ml裂解液RZ，用匀浆仪进行匀浆处理；2)将匀浆样品在18℃放置5min，使得核算蛋白复合物完全分离，4℃12000rpm离心5min，取上清，加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15sec，室温放置3min；4℃12000rpm离心10min后将水相转移到新管中；3)在内有水相的新管中缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱中，4℃12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，向吸附柱中加入500μl去蛋白液，4℃12000rpm离心30sec，弃废液；向吸附柱中加入600μl漂洗液，室温静置2min，4℃12000rpm离心30sec，弃废液；重复操作此步骤一次；将吸附柱放入2ml收集管中，4℃12000rpm离心2min，去除残余液体，放在超净工作台上通风片刻，以充分晾干；4)将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加50μlRNase‑Free ddH₂O，室温放置2min，4℃12000rpm离心2min，所得产物于‑70℃保存待用。