[发明专利]一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法

摘要

本发明提供了一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法，由提取菌种、感染、取材、悬液制备、扩大培养、计数、灭活、合成、稀释、分装、检验十一个步骤组成，所制备的斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗由爱德华氏菌，再加入适量双抗及防腐剂组成，本发明成本低廉，操作方便，可有效提高斑点叉尾鮰免疫力，防治斑点叉尾鮰爱德华氏菌病发生。

主权项

一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）、提取菌种：从患有明显爱德华氏菌病症状的斑点叉尾鮰肝脏、肾脏、血液、腹水中分离出病原菌爱德华氏菌，立即放入4‑8℃的冰箱中保存；（2）、感染：将分离的病原菌接种于健康的斑点叉尾鮰体内，在室内进行感染试验，每尾斑点叉尾鮰接种的病原菌数为1×10⁹‑2×10⁹个 ，检查是否有毒力，证明确有毒力才用作制疫苗材料；将分离的病原菌倒入灭菌空试管中，用无菌生理盐水稀释调节菌浓度，与麦氏比浊管进行比色，使菌浓度达到5×10⁹cfu/ml；（3）、取材：取上述斑点叉尾鮰发病组织材料，称重，每克组织材料中加0.85%生理盐水10毫升，用研钵或匀浆器进行匀浆，制成10%浓度的组织悬液，将制得的组织悬液直接置于‑30℃～‑40℃低温冰箱中保存，或者向制得的组织悬液中按10%加入50%的磷酸缓冲甘油，将其置4‑8℃的冰箱中保存；  （4）、悬液制备：将步骤（3）分离出的致病菌爱德华氏菌接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基内，培养24‑48小时，加入少量生理盐水，用接种环将菌苔刮下，充分振荡，制成细菌分布均匀的悬液； （5）、扩大培养：取单个菌落在25‑30℃条件下培养48‑72小时，振荡使培养斜面上的菌落洗下，或用灭菌接种环轻轻刮下，进行灭活处理； （6）、灭活：将扩大培养结束的爱德华氏菌悬液摇匀，放入60‑70℃恒温水浴1.5‑2.5小时灭活或32℃恒温水浴中70‑73小时灭活，即制成灭活疫苗； （7）、合成：将灭活后的菌液置于高速离心机中，用3000转/分离心机离心30‑40分钟，分离出上清液，向分离出的上清液中添加一定量的青霉素、链霉素和浓度为10％ 的福尔马林溶液，并摇匀； （8）、稀释：用0.85％的无菌盐水稀释灭活菌液至浓度为5×10⁹cfu/ml； （9）、分装：将稀释后的灭活菌液，置于4‑8℃冰箱中保存备用；（10）、检验：对上述稀释好的灭活菌液进行无菌、安全及免疫效果三项检验，要求，灭活菌液中没有活菌存在，灭活细菌的安全的系数要达到100%，免疫保护率达到80%以上；（11）、检验合格后的灭活菌液，继续置于4‑8℃冰箱中保存备用， 步骤（10）所述的无菌检验方法具体操作是：提取 0.2ml 灭活菌样本接种在普通营养琼脂培养基上，在25‑28℃条件下培养48小时，观察是否形成菌落，若形成菌落则说明疫苗含菌，必须重新灭活，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在；步骤（10）所述的安全检验方法具体操作是：对当年健康斑点叉尾鮰鱼种进行腹腔注射，每尾注射0.3‑0.5毫升，在水温25‑28℃的水缸中饲养，经 15d 观察无发病或死亡说明该灭活细菌是安全的，必须做到100%安全才可使用；步骤（10）所述的免疫效果检验方法具体操作是：在给健康斑点叉尾鮰接种上述制备的疫苗，二周后进行攻毒，观察免疫保护率，具体操作方法是取上述疫苗，每尾斑点叉尾鮰注射疫苗量为0.3‑0.5 ml ，每天观察斑点叉尾鮰的发病及症状等情况并做好记录，另外用新鲜的或甘油保存的病鱼组织制成的未经灭活处理的浓度为10%的悬液，分别注射到已注射过疫苗的斑点叉尾鮰和没有注射过疫苗的斑点叉尾鮰体内进行对照，每尾按0.3‑0.5毫升进行腹腔注射，继续观察15天，如果对照组全部发生爱德华氏菌病，死亡率在70％以上，病斑点叉尾鮰症状与天然发病的症状一样或相似，而免疫组仍健康存活，免疫保护率在80%以上，证明此疫苗有效。