[发明专利]一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法

摘要

本发明涉及一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法。该方法主要步骤是：取室内烟草种子发芽获得的无菌苗叶片，采用CTAB小样法提取烟草基因组DNA，并以此DNA为模板使用烟碱转化特异引物进行PCR扩增，采用2％的琼脂糖凝胶电泳分离和展示PCR扩增产物，在凝胶成像系统中观察、读取和统计分子标记带谱，并与对照特征带谱进行比较以筛选烟草高和低烟碱转化材料。本发明所述方法不受环境条件和季节影响，也不需人工化学诱导烟碱转化，将高和低烟碱转化株筛选提前至播种前，大大节约了时间成本和经济成本，而且本方法精准高效，操作简便，易于集中和推广，可用于不同烟草类型高和低烟碱转化材料的筛选，也可用于针对烟碱转化特定性状进行的快速纯化和鉴定。

主权项

1.一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法，其特征在于具体步骤依次如下：A、将用于烟碱转化株筛选的白肋烟和马里兰烟烟草种子放入已标识的2ml无菌离心管中，倒入浓度为70-75％的乙醇进行表面消毒50-60s，无菌水漂洗1次，时间为3-5min，用移液枪吸走无菌水，再用饱和次氯酸钙(Ca(ClO)2)溶液消毒8-10min，封盖上下翻动多次以充分消毒，无菌水漂洗多次以去除残留的Ca(ClO)2溶液，用移液枪吸走无菌水后，用去尖头的枪头吸取消毒后的种子播种于MS固体培养基上，往培养基中加1-2ml无菌水，保证种子的正常吸胀发芽，消毒、封口后轻轻摇晃培养基，使种子在培养基中分布均匀，标识后置于光照培养室发芽；B、待白肋烟和马里兰烟烟苗长出5-6片真叶后，每个材料各取3株，每株采集1-2片真叶，采用CTAB小样法提取基因组总DNA，纯化后-20℃保存备用；C、基因组DNA的PCR反应：用紫外分光光度计测定B步骤中DNA的浓度，然后将其浓度稀释成50-60ng/μL作为DNA反应模板进行PCR反应，所采用的烟碱转化特异引物序列：正向引物：5’-ATTGGCCCAATTGCCAAATGGATTACTGC-3’，反向引物：5’-TGCGAGTCGAGCGTACTCAATCTAT-3’；D、PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳及电泳结果的读取：将步骤C中所获得的PCR扩增产物与溴酚蓝-甘油溶液以4：1的体积比混合，注入浓度为2％的琼脂糖凝胶样品槽中，同时注入100bp的DNAladder，通电开始电泳，结束后取出凝胶，清除表面的溴化乙锭(EB)溶液，然后将胶板放入凝胶成像系统的观察板上，在波长为254nm的紫外灯下进行观察，拍照并记录电泳图谱以备比较分析；E、白肋烟和马里兰烟烟草高和低烟碱转化株筛选：用C步骤中的烟碱转化特异引物PCR扩增高烟碱转化和低烟碱转化对照品种获得的PCR特征带谱作为鉴定和筛选高、低烟碱转化株的依据，被筛选出的高、低烟碱转化烟苗保留备用。