[发明专利]一种片段法固相合成齐考诺肽的方法

摘要

本发明属于多肽合成领域，涉及一种片段法固相合成齐考诺肽的方法。本发明所要解决的技术问题是现有制备方法存在的合成周期长、粗肽纯度低、3对二硫键形成过程操作繁杂、总收率低等技术难题。本发明所采用的技术方案为：首先采用固相法合成齐考诺肽的4个片段肽[19‑25]A、[12‑18]B、[6‑11]C、[1‑5]D；再按照顺序依次将全保护肽片段B、C、D连接到肽树脂A上，裂解得到齐考诺肽线性肽；最后通过条件温和，操作精简，后处理容易，环保的液相一步氧化得到齐考诺肽。此技术方案可以大大缩短合成周期，降低合成、纯化难度和生产成本，提高线性肽纯度和产物的总收率；利于工业大规模生产。

主权项

1.一种片段法固相合成齐考诺肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以氨基树脂为固相载体，再按序列依次偶联7个Fmoc保护氨基酸，得侧链保护的齐考诺肽片段A[19‑25]肽树脂；齐考诺肽片段A[19‑25]肽树脂为：H‑Ser(tBu)‑Cys(Trt)‑Arg(pbf)‑Ser(tBu)‑Gly‑Lys(Boc)‑Cys(Trt)‑氨基树脂；(2)以CTC树脂为固相载体，按照以下序列从C端向N端依次进行缩合反应得到侧链全保护的齐考诺肽片段B[12‑18]肽树脂、片段C[6‑11]肽树脂和片段D[5‑1]肽树脂；齐考诺肽片段B[12‑18]肽树脂为：Fmoc‑Met‑Tyr(tBu)‑Asp(OtBu)‑Cys(Trt)‑Cys(Trt)‑Thr(tBu)‑Gly‑CTC树脂；齐考诺肽片段C[6‑11]肽树脂为：Fmoc‑Ala‑Lys(Boc)‑Cys(Trt)‑Ser(tBu)‑Arg(pbf)‑Leu‑CTC树脂；齐考诺肽片段D[1‑5]肽树脂为：Fmoc‑Cys(Trt)‑Lys(Boc)‑Gly‑Lys(Boc)‑Gly‑CTC树脂；(3)将片段B、C、D的肽树脂进行裂解，得到全保护肽片段B、C、D，其结构为：齐考诺肽片段B[12‑18]为：Fmoc‑Met‑Tyr(tBu)‑Asp(OtBu)‑Cys(Trt)‑Cys(Trt)‑Thr(tBu)‑Gly‑OH；齐考诺肽片段C[6‑11]为：Fmoc‑Ala‑Lys(Boc)‑Cys(Trt)‑Ser(tBu)‑Arg(pbf)‑Leu‑OH；齐考诺肽片段D[1‑5]为：Fmoc‑Cys(Trt)‑Lys(Boc)‑Gly‑Lys(Boc)‑Gly‑OH；(4)齐考诺肽片段A[19‑25]肽树脂与全保护肽片段B在缩合剂存在下发生接肽反应，生成14个氨基酸的肽树脂，再按照同样的操作依次连接全保护肽片段C和D，最后脱除Fmoc，完成齐考诺肽线性肽树脂的制备；齐考诺肽线性肽树脂的结构如下：H‑Cys(Trt)‑Lys(Boc)‑Gly‑Lys(Boc)‑Gly‑Ala‑Lys(Boc)‑Cys(Trt)‑Ser(tBu)‑Arg(pbf)‑Leu‑Met‑Tyr(tBu)‑Asp(OtBu)‑Cys(Trt)‑Cys(Trt)‑Thr(tBu)‑Gly‑Ser(tBu)‑Cys(Trt)‑Arg(pbf)‑Ser(tBu)‑Gly‑Lys(Boc)‑Cys(Trt)‑氨基树脂；(5)肽树脂经裂解试剂裂解得到齐考诺肽的线性肽粗品；(6)将齐考诺肽的线性肽用乙酸铵和EDTA的缓冲水溶液溶解后，加入辅助氧化剂，调节溶液pH值至7.5～8.5，2～8℃下低温静置反应，HPLC监测反应终点，得到含二硫键的齐考诺肽粗品；所述步骤(6)中齐考诺肽线性肽的浓度为0.5～2mg/ml，乙酸铵的浓度为0.5～0.7mol/L；EDTA的浓度为0.5‑1.5mmol/L；所述步骤(6)中辅助氧化剂组合为GSH(还原型谷胱甘肽)/GSSG(氧化型谷胱甘肽)、半胱氨酸/胱氨酸中的一种；所述氧化剂组合GSH(还原型谷胱甘肽)/GSSG(氧化型谷胱甘肽)中GSH(还原型谷胱甘肽)的加入浓度为0.1‑10mmol/L，GSSG(氧化型谷胱甘肽)的加入浓度为0.05‑1mmol/L；所述氧化剂组合半胱氨酸/胱氨酸中半胱氨酸的加入浓度为0.1‑10mmol/L，胱氨酸的加入浓度为0.05‑1mmol/L；(7)将齐考诺肽粗品溶液pH值调至3‑6后经制备色谱纯化，冻干得到齐考诺肽精肽。