[发明专利]利用海洋黄柄曲霉HN4-13菌株制备大黄素-8-甲醚的方法与用途

摘要

本发明是一种利用海洋黄柄曲霉HN4‑13菌株制备大黄素‑8‑甲醚的方法，该方法以哈氏弧菌为指示菌，采用硅胶柱层析、Sephadex LH‑20柱层析和制备高效液相色谱（PHPLC）等方法对黄柄曲霉HN4‑13菌株发酵产生的抗菌活性物质进行分离和纯化，得到1个抗哈氏弧菌活性化合物HY2，通过ESI‑MS、¹H‑NMR、¹³C‑NMR等波谱数据对其结构进行鉴定，确定HY2为大黄素‑8‑甲醚。本发明方法从黄柄曲霉HN4‑13代谢产物中分离得到大黄素‑8‑甲醚（questin），并且实验证明大黄素‑8‑甲醚（questin）对水产病原哈氏弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌均具有一定的抑制作用，可用于制备抗水产病原弧菌的药物。

主权项

1.一种利用海洋黄柄曲霉HN4‑13菌株制备大黄素‑8‑甲醚的方法，其特征在于，步骤如下：（1）HN4‑13菌株发酵液的制备：用500 mL三角瓶对HN4‑13菌株进行发酵，每瓶装量为200 mL，共发酵100瓶；培养基成分为：葡萄糖 3%，蛋白胨 0.3%，KCl 0.25%，NaH₂PO₄ 0.1%，NaCl 3%，蒸馏水，用NaOH调节pH至10；发酵条件为：种子液的菌龄为24 h，接种量4.5%，温度32°C，摇床转速160 rpm/min，发酵时间8 d，得到HN4‑13菌株的发酵产物；将发酵产物经8层纱布过滤，弃去菌体后得到发酵液；（2）抗菌活性提取物的制备：HN4‑13菌株发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3次，静置12 h后，合并乙酸乙酯相，减压蒸发浓缩后得到活性粗浸膏；（3）抗菌活性物质的分离纯化：a. 硅胶柱层析：将上述获得的活性粗浸膏用乙酸乙酯溶解后，加入30 g硅胶拌样，减压蒸干；采用6×60 cm减压硅胶层析柱进行减压分离，以0–100% v/v石油醚:二氯甲烷、0–100% v/v二氯甲烷:甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱500 mL，减压浓缩至干燥，共得到9个组分；将9个组分分别取5 mg，用甲醇定容至浓度10 mg/mL，各取100 µL测定对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑制活性；二氯甲烷:甲醇为25:1洗脱得到的组分5具有抑制活性；b. Sephadex LH‑20柱层析：将活性组分5用2.0×80 cm的Sephadex LH‑20 柱进行层析分离，湿法上样，以甲醇为洗脱液进行等度洗脱，流速20 mL/h，用10 mL玻璃瓶收集洗脱液；洗脱液通过高效液相色谱HPLC分析，合并相同组分后得到3个亚组分；将3个亚组分进行哈氏弧菌(Vibrio harveyi)抑菌活性检测，其中抑菌圈大于20 mm的为亚组分5‑2；c. 制备高效液相色谱PHPLC制备活性化合物：将亚组分5‑2进行HPLC分析，发现在80:20 v/v甲醇:水梯度下可直接制备得到；利用制备高效液相色谱PHPLC，以80:20 v/v甲醇:水进行等度洗脱，从亚组分5‑2中纯化得到化合物HY2，即大黄素‑8‑甲醚。