[发明专利]一种人源星形胶质前体细胞的制备方法及培养基

摘要

本发明公开了一种人源星形胶质前体细胞的制备方法及培养基。通过本发明的方法，可以在体外获得大量的星形胶质前体细胞，与由神经干细胞直接分化星形胶质细胞的传统方法相比，本发明获得的前体细胞具有强增殖能力以及定向分化为星形胶质细胞的能力，短期内能迅速得到大量高纯度的星形胶质细胞；用于培养星形前体细胞的培养基具有成分确定，商品可得的特点；用于大量产生用于科研或者临床的星形细胞的手段具有成本低廉、安全性高、生产效率高、可操作性强的特点。

主权项

1.一种人源星形胶质前体细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）将诱导多能干细胞接种于细胞专用培养板中，采用 mTeSR 干细胞培养基、于 37℃条件下对诱导多能干细胞进行培养，每隔 6—8 天传代一次，每天更换新鲜的 mTeSR 干细胞培养基；（2）诱导多能干细胞传代第 5 天后，用无菌的 PBS 缓冲液润洗细胞表面，然后加入拟胚体分化培养基；用无菌细胞刮子轻刮诱导多能干细胞细胞团边缘，使诱导多能干细胞细胞团脱离培养板并处于悬浮状态，然后反复吹打使诱导多能干细胞细胞团分散，将分散后的诱导多能干细胞细胞团转移至细胞培养皿，补加拟胚体分化培养基后在 37℃条件下震荡培养 5 天以上，每 2 天更换一次新鲜的拟胚体分化培养基；（3）诱导多能干细胞细胞团悬浮震荡培养 5 天后，形成大小均一、构造类似的拟胚体球状结构的拟胚体细胞团；将拟胚体分化培养基更换为由N2培养基、 B27培养基和 DMEM/F12 无血清培养基混合成的混合培养基 A，该混合培养基 A 中添加有生长因子bFGF和生长因子 EGF，生长因子bFGF和生长因子 EGF 在混合培养基 A 中的浓度均为10μg/L；将拟胚体细胞团与混合培养基 A 一起移至由基质胶 Matrigel 包被的培养皿中，轻摇培养皿使拟胚体细胞团平均分散于培养皿底面，37℃条件下静置培养 5—7 天，每两天更换一次新鲜的混合培养基 A；拟胚体细胞团中央定向分化为玫瑰花状结构的神经前体细胞团；（4）用无菌针挑出神经前体细胞团并置于无菌离心管中，添加相当于离心管2/3 体积的 DMEM/F12 无血清培养基，于 1000rpm 条件下离心，收集细胞，然后更换新鲜的由 N2 培养基、B27 培养基和 DMEM/F12 无血清培养基混合成的混合培养基 B，该混合培养基 B 中添加有生长因子 bFGF、生长因子 BMP‑4 及替代血清的 KSR 的培养基，生长因子 bFGF 在混合培养基 B 中的浓度为 10μg/L，生长因子 BMP‑4 在混合培养基 B 中的浓度为 20μg/L，替代血清的 KSR 的培养基的添加量为混合培养基 B 总体积的 10%；吹打收集的细胞沉淀，使细胞沉淀重悬于新鲜培养基中，形成细胞液，将细胞液平铺于基质胶包被的细胞培养皿中，于 37℃条件下静置培养 3 天后，细胞液中的细胞体积膨大，开始分化为星形胶质前体细胞，增殖的细胞开始表达低水平的 GFAP 标志蛋白，即得人源星形胶质前体细胞；1L 步骤（2）所述拟胚体分化培养基中含有 DMEM/F12 无血清培养基 990mL，N2 培养基 10mL，还含有 A‑8301 和 Dorsomorphin，A‑8301 和 Dorsomorphin 在拟胚体分化培养基中的浓度为 1 μmol/L。