[发明专利]一种辅酶再生系统及其制备方法

摘要

本发明提供一种辅酶再生系统，其包括：甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，FDH)、亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase，LDH)和甲酸铵。本发明同时还提供了该辅酶再生系统的制备方法，主要包括步骤(1)甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶的异源表达；2)配制辅酶再生系统。本发明的辅酶再生系统，辅酶再生效率高，制备方法简单方便，极大地降低了辅酶反应的成本，适用于大规模的工业化应用。

主权项

1.一种辅酶再生系统，其特征在于，所述辅酶再生系统包括甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，FDH)、亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase，LDH)和甲酸铵以及磷酸吡哆醛，所述辅酶再生系统中的甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶来自基因工程菌发酵液，所述基因工程菌同时表达甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶，所述基因工程菌中具有质粒pFDH‑pET28a和质粒pLDH‑pET21a，所述辅酶再生系统由包括下列步骤的方法制备：(1)甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶的异源表达构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌，经发酵制得含FDH和LDH的酶液，包括下列步骤：(a)构建FDH载体将FDH基因连入使用核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET28a载体，构建得到重组表达FDH的质粒pFDH‑pET28a；(b)构建LDH载体将LDH基因连入使用核酸内切酶XhoⅠ和NdeⅠ双酶切的pET21a载体，构建得到重组表达质粒pLDH‑pET21a；(c)构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌将质粒pFDH‑pET28a和质粒pLDH‑pET21a共转入E.coli BL21(DE3)，得到共表达FDH与LDH的菌株E.coli BL21‑FDH/LDH；(d)发酵所述菌株E.coli BL21‑FDH/LDH，制备所述含FDH和LDH的酶液将共表达菌株E.coli BL21‑FDH/LDH在含Amp和Kan的LB液体培养基中培养，加入IPTG至终浓度为0.01～0.05mmol/L，16～27℃诱导表达12～20h，发酵液经菌体破壁后离心取上清即得所述FDH/LDH共表达酶液；(2)配制辅酶再生系统在缓冲液中配制辅酶再生系统，所述辅酶再生系统包括：所述含FDH和LDH的酶液、甲酸铵、NAD+、和磷酸吡哆醛。