[发明专利]一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法

摘要

一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，它属于环境对鱼体遗传毒理学评价领域。方法：一、制备鱼肌肉组织的细胞悬液；二、彗星实验采用双层凝胶结构，进行裂解；三、裂解后冲洗，放入电泳缓冲液中电泳；四、电泳结束后载玻片经冲洗、晾干后移去盖玻片，染色后清洗，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察彗星图像，然后计算细胞受损率或分析图像，再分析结果，即完成。本发明优点在于具有高灵敏性，无需放射性示踪，并且这种技术只需要少量细胞，操作简单、直观、检测快速和具有良好经济性，相比试剂盒更为廉价；还为鱼体遗传毒性进行定性、定量化评价提供支持，了解其江河水产质量、水质情况及其鱼体遗传毒理现状。

主权项

一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于它按以下步骤实现：一、称取鱼肌肉组织0.8mg，放入离心管中，加入400μL 4℃预冷的PBS，用科弯剪剪成糜状，然后用匀浆器研磨，过100目筛网，再用2mL的PBS冲洗并滤去碎组织，取400μL滤液，置于离心管待用，获得细胞悬液；步骤一的操作全程于0～4℃下进行；二、彗星实验采用双层凝胶结构，双层凝胶制备好后，将载玻片放置在4℃冰箱中0.8～1.2h，然后放入4℃预冷的新配制细胞裂解液中，4℃下避光裂解1.5h；三、裂解后将载玻片取出，用双蒸水冲洗，然后放入盛有4℃的新配制电泳缓冲液的水平电泳槽中静止30min，再在4℃，300mA，0.7V/cm的条件下电泳20min；四、电泳结束后将载玻片用去离子水冲洗3次，晾干后移去盖玻片，将载玻片用50μl EB染液染色15～20min，然后用双蒸水清洗，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察彗星图像，在100倍荧光显微镜下随机选取8～12个清晰细胞核图像进行观察并用CCD拍摄彗星图像，然后计算细胞受损率或用casp软件分析图像，再使用spss统计软件分析结果，即完成鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验。