[发明专利]一种快速高效的曼陀罗原生质体制备方法

摘要

本发明公开了一种快速高效的曼陀罗原生质体制备方法，属于植物细胞工程领域。本发明利用茎尖组织培养技术获得了无菌的曼陀罗组培苗，以曼陀罗组培苗的幼叶为起始材料，采用纤维素酶(Cellulase)R10和离析酶(Macerozyme)R10，对曼陀罗幼叶组织进行酶解消化，并利用蔗糖密度梯度离心方法分离获得高质量的曼陀罗原生质体，产量高达1.4×106个/克。分离得到的原生质体富含叶绿体，且细胞膜完整，绝大多数呈球形，具有较高活力，能满足后续各种研究需要。

主权项

1.一种曼陀罗原生质体制备方法，其特征在于，利用茎尖组织培养技术获得了无菌的曼陀罗组培苗，以曼陀罗组培苗的幼叶为起始材料，采用纤维素酶R10和离析酶R10，对曼陀罗幼叶组织进行酶解消化，并利用蔗糖密度梯度离心方法分离获得曼陀罗原生质体，具体的步骤如下：(a)曼陀罗茎尖培养：剪取曼陀罗栽培苗的茎尖带幼芽部位，消毒后转移至MS培养基中；(b)曼陀罗组培苗培养：将步骤(a)的消毒茎尖在MS培养基上培养3～5周，直至其长出展开的叶片；培养条件：22～28℃，光照14～18h；(c)原生质体酶解：在一9cm直径的细胞培养皿中，加入20mL溶液A；剪取5～7片步骤(b)组培苗展开的幼叶，快速用剪刀剪成1mm的条状，置于溶液A中，于25℃暗中静置培养2～3h后，用移液器弃溶液A，置换20mL新的溶液A，分别加入质量体积百分比为10％的纤维素酶R10溶液和质量体积百分比为10％的离析酶R10溶液各500μL，置于水平摇床中，于22～28℃黑暗条件下，以55～60rpm的转速过夜；(d)原生质体分离：用70μm细胞筛网过滤步骤(c)的酶解液至无菌的50mL离心管中，并用20mL溶液A冲洗筛网上的叶片残渣，然后用移液器在滤液上层缓慢滴加10mL溶液B，避免与溶液A混溶；25℃下用100g离心力离心15min，用无菌吸管吸取溶液A和溶液B之间的原生质体，即得到所需的原生质体，其中，溶液A和溶液B的试剂组成如下：成分溶液A/L溶液B/LKNO₃1.012g1.012gCaCl₂0.332g0.332gMgSO₄·7H₂O0.370g0.370gKH₂PO₄0.170g0.170gMES1.952g1.952g6‑苄腺嘌呤 1mg/mL1mL1mL萘乙酸1mg/mL100μL100μL微量无机盐溶液100×10mL10mL1M琥珀酸铵溶液20mL20mL维生素盐溶液100×10mL10mL蔗糖130g20g葡萄糖/65g蒸馏水定容至1L定容至1L