[发明专利]一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒

摘要

本发明涉及一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，属于生物技术领域。本发明提供一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，包括农杆菌菌液培养，农杆菌细胞破碎，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱具体步骤，得到DNA水溶液，于1-2%琼脂糖凝胶中电泳检测。常规的农杆菌质粒提取步骤繁琐，操作麻烦，一般需要4h左右才能完成农杆菌质粒DNA的提取。利用本发明提供的试剂盒仅需1.5h即可完成农杆菌质粒DNA的提取，该试剂盒与常规提取方法相比不仅节省了大量时间，同时也更加方便、快捷，具有一定的经济效应。

主权项

一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，包括农杆菌菌液培养，农杆菌细胞破碎，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，其特征是：农杆菌菌液培养：挑取含有质粒的农杆菌菌株接种到50‑100ml YEB 液体培养基中，在恒温摇床上28‑30℃,160‑200rpm/h,培养40‑48h，吸取2‑4ml菌液于5ml离心管中，10000‑13000 rpm/min离心5‑10min，弃上清，保留沉淀；农杆菌细胞破碎：往含有农杆菌沉淀的5ml离心管中加入3‑4ml Buffer A,漩涡悬浮菌体后10000‑13000rpm/h离心3‑5min，弃上清，保留沉淀；往沉淀中加入3‑4ml Buffer A,漩涡悬浮菌体后10000‑13000rpm/h离心3‑5min，弃上清，保留沉淀；往沉淀中加入0.4‑0.5ml Buffer B，漩涡悬浮菌体，室温下静止10‑20min，加入0.8‑1ml新配置的Buffer C，上下颠倒离心管5‑10次，室温下静止10‑20min，加入0.4‑1ml Buffer D，轻柔颠倒离心管数次，使其充分混匀；加入0.2‑1ml Buffer E，轻柔颠倒离心管数次，使其充分混匀，将离心管冰浴5‑10min后10000‑13000rpm/h离心10‑15min，将上清转入新的离心管中；加入与上清等体积的Buffer F溶液抽提，10000‑13000rpm/min 离心5‑10分钟，将上清转移至新的离心管中；加入与上清等体积的Buffer G抽提，10000‑13000rpm/min 离心10‑20分钟，将上清转移至新的离心管中；DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往离心管中加入两倍体积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱，10000‑13000rpm/min 离心1‑2min，弃废液，加入500‑600μl去蛋白液， 10000‑13000rpm/min 离心1‑2min，弃废液，加入300‑500μl漂洗液，12000‑13000rpm/min 离心1‑2min，弃废液，加入500‑600μl漂洗液，12000‑13000rpm/min 离心1‑2min，弃废液， 12000‑13000rpm/min 离心1‑2min，静置吹干；DNA洗脱：往吸附柱中加入30‑60μl洗脱液，12000‑13000rpm/min 离心1‑2min，所得液体为农杆菌质粒DNA，取3‑6μl DNA水溶液，于1‑2%琼脂糖凝胶中电泳检测。