[发明专利]一种组织工程角膜的制备方法

摘要

本发明属于组织工程技术领域，提供了一种组织工程角膜的制备方法，采用人角膜缘细胞复合动物源性角膜制备的支架材料的方式，将前弹力层、基质层和后弹力层分离，涂布人角膜缘细胞制备的细胞混悬液，后通过交联，粘合等方式完成含细胞的组织工程角膜构建，此方法制备的组织工程角膜在使用方面具有组织相容性高，可以产业化制备等优点。同时所采用细胞未经过体外扩增培养，细胞性状稳定，不易分化，保证了组织工程角膜的安全性。

主权项

一种组织工程角膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，步骤一、动物源性角膜的选取和前处理：选取包含有前弹力层的动物源性角膜，将其置于添加抗生素的、温度在2～30℃的去离子水中浸泡8～24h，待所述动物源性角膜厚度溶胀到2～5倍厚度后，该动物源性角膜的上皮细胞层会由于后弹力层胀起而脱落，同时抗生素的使用，可以有效去除该动物源性角膜组织的细菌，获得无菌的、去除了上皮细胞层的动物源性角膜组织材料；步骤二、角膜各层的分离：将步骤一制备所得的动物源性角膜组织材料置于角膜切削设备中，切削获得前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，实现角膜各层的分离；步骤三、将步骤二制备所获得的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片去抗原、病毒灭活处理后，采用质量百分比浓度为60%～95%的甘油对去抗原、病毒灭活处理后的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片进行脱水处理，然后在2～30℃的温度条件下，使前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片恢复至溶胀前的生理状态，同时置于所述甘油中保持待用；步骤四、制备细胞混悬液：将人角膜缘组织置于25～37℃预热的胰酶溶液中消化细胞，胰酶浓度为0.1%～0.25%，消化时间为1～10min，后采用人血清终止消化，800～1200rpm离心收集细胞，随后采用溶液A将收集的细胞制备成细胞混悬液，待用；所述溶液A是体积百分数为10%～30%的人血清、胶原溶液和透明质酸溶液中的任一种或两种的混合或三种的混合溶液；所述细胞混悬液的细胞浓度为1×104至2×105个细胞每毫升；步骤五、组织工程角膜的构建：将步骤四制备的细胞混悬液涂布于步骤三制备的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片上，在25～37℃下静置至少30min后，让细胞有效附着于弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片的表面；再将表面上附着了细胞的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，以后弹力层组织片在下、基质层组织片居中和前弹力层组织片在上的顺序堆叠，同时对其进行交联和加固以固定各层，制得所述组织工程角膜。