[发明专利]一种皮肤溃疡修复基质的制备方法

摘要

本发明提供了一种皮肤溃疡修复基质的制备方法，采用脱细胞、去抗原和增厚处理后的天然细胞外基质作为生物支架，复合种子细胞在天然细胞外基质表面形成具有多层细胞的细胞膜，经冷冻干燥处理即得皮肤溃疡修复基质,实现了细胞外基质表面细胞复层化和细胞外基质内部部分细胞长入的效果，能够有效保护促进创面的修复，较少瘢痕的形成,制备周期短，工艺简单，适合产业化，适用范围宽，创面修复效果好，愈合的创面与正常皮肤的弹性和韧性相近。采用冻干灭菌处理，不仅保证了产品具有预期的使用效果，并且能够延长保质期，大大降低了运输和储存的要求。

主权项

1.一种皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：采用脱细胞、去抗原和增厚处理后的天然细胞外基质作为生物支架，复合种子细胞在天然细胞外基质表面形成具有2～10层的多层细胞的细胞膜，经冷冻干燥处理后即得皮肤溃疡修复基质；/n所述种子细胞是自体或同种异体来源的成纤维细胞或干细胞；/n所述的皮肤溃疡修复基质的制备方法，包括以下步骤：/n1)步骤一、细胞外基质的制备：将完成脱细胞去抗原和灭活处理的胶原膜组织用碱液浸泡进行增厚处理，然后用0.01～0.05M PBS溶液进行清洗至pH为6～7为止，并用所述PBS溶液浸泡1～6小时得到细胞外基质，然后用10～25kGy钴60辐照灭菌后备用；/n2)步骤二、培养基的配制：/n2.1)、配制基础液：按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与胎牛血清或新生牛血清混合为基础液；/n2.2)、配制基础培养基：按500ml所述基础液标准加入胰岛素1～100ng，转铁蛋白1～50mg，亚硒酸钠1～30μg，氢化可松10～600μg，表皮细胞生长因子1～20μg，碱性成纤维细胞生长因子1～100ng，转化生长因子β1～100ng，维生素C1～100mg，配制成基础培养基；/n2.3)、配制培养基：向所述基础培养基中分别添加牛垂体提取液10～30μg/ml、腺嘌呤1～50mg、HRG 50～300ng/ml和血小板衍生因子1～20ng/ml，分别配制成以下四种不同的培养基：/n培养基a：基础培养基+牛垂体提取液10～30μg/ml；/n培养基b：基础培养基+腺嘌呤1～100μg/ml；/n培养基c：基础培养基+HRG 50～300ng/ml；/n培养基d：基础培养基+血小板衍生因子1～20ng/ml；/n其中，所述牛垂体提取液、腺嘌呤、HRG和血小板衍生因子的浓度为终浓度；/n3)步骤三、种子细胞的分离和体外培养：采用组织贴壁法从所需的组织中进行种子细胞的分离，或采用酶消化法从所需的组织中进行种子细胞的分离，或用差速贴壁法从所需的组织中进行种子细胞的分离；/n并用F12或MEM或DMEM或RPMI-1640培养基混合5％～20％的胎牛血清进行体外传代培养，培养温度为25～38℃，3％～7％的CO2浓度；/n4)步骤四、接种细胞和三维培养：在无菌环境下，按1×104～10×106个/cm