[发明专利]卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法

摘要

一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法，包括以下步骤1）配制实验试剂；2）制备卷烟烟气总粒相物；3）细胞接种培养；4）卷烟烟气总粒相物染毒；5）样品处理及GSH/GSSG测定；6）结果分析。本发明应用SBB缓冲液重悬细胞，防止人为的氧化GSH，同时增加了样品的有效处理时间；考虑到细胞裂解液中存在活性巯基的蛋白质，为了减少非谷胱甘肽的硫化物与DTNB结合而干扰检测，在样品测定前，加入5‑磺基水杨酸用于脱去样品中蛋白质，减少了测定过程中的干扰；由于本方法同时检测GSH和GSSG，在结果处理时应用了差减法，可分别得到GSH和GSSG浓度，本发明具有耗时短，操作简便，灵敏度高，结果可靠的优点。

主权项

一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：1）配制实验试剂，各实验试剂的配制方法如下：(1)生长培养液：RPMI‑1640，10 %胎牛血清，2 mM L‑谷氨酰胺，100 IU/ml青霉素，100 μg/ml 链霉素；(2)磷酸缓冲盐溶液（PBS）：0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4，8 g NaCl，2.9 g Na2HPO4·12H2O，加双蒸水至1 L，pH 7.2~7.4，高压灭菌；(3) 1 %的胰酶：1 g胰酶定容至100 mL PBS中，冰浴下搅拌3 h~4 h，滤膜过滤，分装到10 mL离心管，于‑ 20℃ 冻存；(4) 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（SBB）：其中含有：100 mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10 mM硼酸盐，5 mM 丝氨酸，1 mM二乙烯三胺五乙酸，PH 7.0；(5) 掩蔽剂：v/v 25 %的2‑乙烯基吡啶无水乙醇溶液；(6)脱蛋白质剂：5‑磺基水杨酸；(7) GSSG标准溶液：12.5 μM的GSSG标准液用PBS逐级2倍稀释至0.195 μM；(8)反应混合液：由以下三种溶液定量混合而成： 15 mM DTNB 300 μL，5 U/mL谷胱甘肽还原酶200 μL，4.0 mL PBS缓冲液；(9) 还原型辅酶Ⅱ(NADPH）溶液: 10 mL PBS溶解100 mg 的NADPH，使用时稀释至 2 mg/mL；(10)阴性对照：v/v 2 %二甲基亚砜（DMSO）；2）制备卷烟烟气总粒相物；3）细胞接种培养；4）卷烟烟气总粒相物染毒：用生长培养液将卷烟烟气总粒相物储存液调整到不同浓度，终浓度设置至少包括2个非零浓度，使细胞存活率在70 %以上，培养24 h后的细胞，吸去培养液，6孔板中阴性对照组每孔加入2.5 mL 20 μg/mL DMSO生长培养液，实验组每孔加入2.5 mL含有不同浓度卷烟烟气总粒相物的生长培养液，于37 ℃、5 % CO2条件下培养24 h；5）样品处理及GSH/GSSG测定：细胞孵育24 h后，吸去培养液，每孔加入1 mL 37℃预热的PBS洗一次, 经胰酶消化制得细胞团样品，细胞团样品在1.5 mL离心管中重悬于500 μL SBB缓冲液中，细胞超声破碎仪破碎细胞，功率300 W， 3 ~5秒/次，间隔10秒，重复3~5次；10000 g、4 ℃下离心10 min，收集上清液，加入v/v 5 %的5‑磺基水杨酸，混均，取50 μL加入1.5 mL离心管，并加入50 μL PBS 稀释，制得检测样品；取96孔板上两列孔，将样品以及标准品，一式两份，每孔50 μL, 加入相应孔内，空白孔加入50 μL PBS缓冲液；其中，用于检测GSSG的一列样品孔内加入掩蔽剂1 μL /孔，另一列样品孔用于检测总的GSH，不加入掩蔽剂；孵化1 min；样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入150 μL反应混合液，孵化2 min；样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入NADPH溶液50 μL；立即在412 nm下测定吸光值OD，每30 s记录一次OD值，记录3 min；6）结果分析：原始吸光值OD0，反应t时间时检测的吸光值ODt；反应t时间内吸光值的变化值ΔODt：ΔODt=ODt‑ OD0；所有检测孔内由相应的ΔODt做关于时间t的一次函数，其中斜率为该孔检测浓度下的ΔOD/min；所有检测孔的ΔOD/min，经空白对照ΔOD/min(空白)校正为ΔOD/min(校正)：ΔOD/min(校正)=ΔOD/min—ΔOD/min(空白)ΔOD1/min： GSH(总)检测孔的ΔOD/min(校正)ΔOD2/min： GSSG检测孔的ΔOD/min(校正)以GSSG标准样品的ΔOD/min(校正)和浓度，拟合标准曲线y = Ax + B样品中GSH/GSSG为：。