[发明专利]一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法

摘要

本发明公开了一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法，具体是构建含有抗生素抗性基因、转座子Tn7左右臂盒子、多克隆位点以及Tn7转座酶TnsABCD片段，以及含有大肠杆菌复制子pBR322 ori和枯草芽孢杆菌温敏复制子的转座整合表达质粒；将枯草芽孢杆菌启动子、信号肽、外源蛋白基因等表达元件插入该转座整合表达质粒，转化到枯草芽孢杆菌宿主，使外源蛋白基因整合到枯草芽孢杆菌glms基因下游3’端的attTn7位点进行表达；并通过变温培养使质粒上的温度敏感复制子失去作用，得到不再保留含有抗生素抗性基因和Tn7转座酶的整合质粒的重组枯草芽孢杆菌。本发明的优点是获得稳定的外源基因转座整合，并且重组菌不含抗生素抗性基因，达到食品安全要求。

主权项

一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于：是通过构建一种用于在枯草芽孢杆菌的转座整合质粒，插入外源蛋白基因及其表达元件后转化枯草芽孢杆菌，通过诱导产生Tn7转座酶TnsABCD，将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌染色体glms基因下游3’端的attTn7位点；通过变温培养，将培养温度从26‑30℃提高到33‑37℃，使转整合表达质粒上的温度敏感复制子失去作用，得到不再保留含有抗生素抗性基因和Tn7转座酶的转座整合质粒的重组枯草芽孢杆菌；将菌落转到不含抗生素的液体营养培养基上培养，能表达出活性蛋白质的菌株即为所需的转座整合表达外源蛋白基因的重组枯草芽孢杆菌，所述的营养培养基是常规的发酵营养培养基，包括蛋白胨或水解蛋白1～50g/L，酵母提取物1～25g/L，氯化钠1～15g/L。