[发明专利]一种李辐射变异材料的早期鉴定方法

摘要

本发明涉及一种辐射育种材料早期鉴定的方法，属于育种鉴定技术领域，所述的方法包括叶片采集、李叶片基因组DNA提取与检测、PCR反应体系、ISSR引物筛选、李辐射诱变材料的ISSR分析、凝胶图像分析。在辐射育种过程中，仅有部分材料发生了变异。果树生长周期较长，采用传统的植物学特征形态鉴定法和花粉显微电镜扫描法等方法进行变异材料的鉴定较为困难。本发明提供的方法可以对李辐射诱变材料进行早期鉴定，操作方便，简单易行。

主权项

1.一种李辐射变异材料的早期鉴定方法，其特征在于：所述的方法包括叶片采集、李叶片基因组DNA提取与检测、PCR反应体系、ISSR引物筛选、李辐射诱变材料的ISSR分析、凝胶图像分析；具体包括以下步骤：1）叶片采集：采集李母树和辐射诱变植株的嫩叶；所述李母树为三月李，辐射诱变植株为辐射迟熟红肉突变体；2）李叶片基因组DNA提取与检测：采用传统CTAB法或植物基因组DNA提取试剂盒进行李叶片基因组DNA的提取，取5μL DNA 溶液用1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA纯度检测，电泳缓冲液为1×TAE Buffer，电泳20min后，凝胶用核酸染料进行染色，并用凝胶成像系统仪进行凝胶图像采集，最后将各材料的DNA浓度稀释至40ng/μL备用；3）PCR反应体系：PCR mix 10 μL，引物0.8μL，模板1μL，水8.2μL，总体积为20μL，PCR反应程序为程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min；4）ISSR引物筛选：以部分材料的基因组DNA为模板，进行ISSR适宜引物筛选；5）李辐射诱变材料的ISSR分析：以筛选出的引物进行李辐射诱变材料DNA的ISSR‑PCR扩增，PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，电泳缓冲液为1×TAE Buffer，电泳30min后，凝胶用核酸染料进行染色，并用凝胶成像仪进行凝胶图像采集；6）凝胶图像分析：将辐射诱变李材料DNA扩增产物的电泳条带，与母树的条带逐一进行比对；所述筛选出的引物为UBC811：GAGAGAGAGAGAGAGAC；UBC816：CACACACACACACACAT；UBC826：ACACACACACACACACC；UBC829: TGTGTGTGTGTGTGTGC；UBC847: CACACACACACACACARC；UBC855: ACACACACACACACACYT；UBC856：ACACACACACACACACYA；UBC857：ACACACACACACACACYG。