[发明专利]一种制备葡萄溃疡病菌分生孢子的方法

摘要

本发明公开了一种制备葡萄溃疡病菌分生孢子的方法。该方法包括：1)将葡萄溃疡病菌接种到PDA培养基上，培养至菌落生长旺盛；2)选取对葡萄溃疡病菌敏感的葡萄品种，将健康的葡萄绿枝条剪成30cm，表面消毒；3)在绿枝条上打孔，去掉韧皮部；菌落用灭菌的打孔器制备菌丝块，将制备好的菌丝块接种于打孔处，用薄膜包裹菌丝块保湿，并将接种过的枝条插入装有无菌水的组培瓶内，于28℃培养；相对湿度大于90％的条件培养48小时，然后湿度维持在70％培养5‑10天。本发明可缩短分生孢子制备时间，制备的孢子悬浮液孢子差异小，质量稳定、致病力强，为葡萄溃疡病菌的致病性测定、群体遗传分化和致病机理解析等提供了保证。

主权项

1.一种制备葡萄溃疡病菌Lasiodiplodia theobromae分生孢子的方法，包括以下步骤：1)将葡萄溃疡病菌Lasiodiplodia theobromae接种到PDA培养基上，在每天11‑13小时光照的条件下，于25‑28℃培养箱中，用9cm的培养皿培养菌株至菌落生长直径为7‑8cm；其中，PDA培养基的制备方法为将洗净去皮的马铃薯200g，加水1L煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯残渣，加水补足至1L，加入20g葡萄糖和20g琼脂粉，加热至琼脂粉溶化，倒入300mL三角瓶中分装，高压湿热灭菌，121℃，20min；2)选取对葡萄溃疡病菌敏感的葡萄品种作为接种材料，将健康的葡萄绿枝条剪成28‑32cm，先表面消毒，再用无菌水冲洗，于灭菌的滤纸上晾干；用灭菌的打孔器在绿枝条上打孔，去掉韧皮部；其中，所述对葡萄溃疡病菌敏感的葡萄品种为夏黑品种葡萄；3)将步骤1)培养获得的菌落用灭菌的打孔器制备菌丝块，将制备好的菌丝块接种于打孔处，用封口膜包裹菌丝块保湿，并将接种过的枝条插入装有无菌水的组培瓶内，于28‑30℃、每天11‑13小时光照的条件下培养；其中，在相对湿度大于90％的条件下培养36‑48小时，然后湿度维持在70‑80％，培养5‑10天；培养5‑7天时，枝条上布满黑色的小点状的分生孢子器，内部有大量分生孢子；步骤2)中，所述打孔器的打孔直径为5‑8mm，打孔的位置选取枝条的中部；所述表面消毒是用次氯酸钠消毒，所述次氯酸钠的质量百分浓含量为1％‑3％，消毒的时间是1‑3分钟；步骤3)中，所述打孔器的打孔直径为5‑8mm；打孔位置沿着菌落边缘；所述方法中还包括将获得的分生孢子制备孢子悬浮液的方法：用剪刀将步骤3)中布满小黑点的葡萄枝条剪成0.5cm大小，放入装有1.5ml无菌水的离心管中，采用研磨枪组织研磨1‑2min，在振荡器上震荡1min，使分生孢子器破裂释放出孢子，然后采用2层脱脂纱布过滤除去枝条残体和菌丝，滤液即为葡萄溃疡病菌的孢子悬浮液。