[发明专利]一种提高哺乳动物体细胞克隆技术效率的方法

摘要

本发明公开了一种提高哺乳动物体细胞克隆效率的方法，其是将卵母细胞去核后，再从去核卵母细胞透明带的任意位置打孔进行移核，本发明的方法将去核操作与移核分开，这样就形成挑成熟卵母细胞、去核、移核以及融合激活同时在一条流水线上同时进行；从而使得体细胞克隆技术工业化，操作形成流水线作业方式，每一个操作员仅仅完成一个操作动作；在相同人员的情况下，一个工作日能制备的克隆重构胚是原来技术的3倍；显著提高了显微操作的效率，降低了技术员的工作强度；简化了技术员的培养过程，使体细胞克隆技术能普及。

主权项

一种提高哺乳动物体细胞克隆效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、按常规方法将哺乳动物卵母细胞在体外成熟培养，在体视显微镜下挑选第一极体排出、细胞膜完整、圆形、卵周隙可见的卵母细胞；(2)、在超净台内，选择培养皿中细胞汇合率60％‑80％，用0.1％胶原酶进行消化，用操作液离心洗涤，调整至10⁶/ml的细胞密度，作为供体细胞，放置于热台备用；(3)、40倍目镜镜下，在去核操作盘操作滴中放入步骤(1)的卵母细胞，调整使持定针高度略高于卵母细胞，吸取一个卵母细胞后，用注射针调整卵母细胞位置，使持定针位于9点钟方向，第一极体位于4点钟方向，调整去核针高度，使其在同一焦距下，从3点钟位置进针，针口置于卵周隙对着第一极体，回吸吸入第一极体和极体后方1/15左右的细胞质，退针吐出吸入的胞质和极体用针下拨卵母细胞，持定针吸走杂质并自动固定下一枚待操作胚胎，如此反复，直到胚胎全部完成；(4)、将步骤(3)去核的操作盘置于另一台操作仪下，取步骤(2)处理好的供体细胞吹打混匀后用移液器移入到细胞操作滴中，将移核针调节到最佳位置，选取中等大小、活力较好的供核细胞吸入移核针中，持卵定针固定去核卵母细胞后，调节移核针至于去核卵母细胞同一平面，稍微给移核针一点向外打供核细胞的力，待供核细胞将要出针口的瞬间快速刺入去核卵母细胞卵周隙，待供核细胞进入去核卵母细胞卵周隙后迅速移出移核针，用针下拨去核卵母细胞，持定针固定下一枚待操作胚胎，如此反复，直到第一批去核的胚胎全部完成移核；(5)、按常规方法进行融合、手术移植，即得转基因哺乳动物。