[发明专利]一种不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其制备方法和应用，(1)将GA2DH基因和PDC基因的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒的多克隆位点，分别得自杀型敲除质粒pΔGOX1231和自杀型敲除质粒pΔGOX1081；(2)将pΔGOX1231电转化转入宿主菌中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子G.oxydans ZJU1；(3)将pΔGOX1081电转化转入经传代后的G.oxydans ZJU1中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取PDC基因敲除的阳性突变子G.oxydans ZJU2。GA2DH是氧化葡萄糖酸形成2-KGA的主要酶，而PDC则与催化丙酮酸脱羧，形成乙醛相关，GA2DH和PDC的敲除可以解决5-KGA形成过程中的代谢分流，减少副产物，实现5-KGA的高产。

主权项

一种不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将GA2DH基因和PDC基因的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒pJKM的多克隆位点，分别得到GA2DH基因的自杀型敲除质粒pΔGOX1231和PDC基因的自杀型敲除质粒pΔGOX1081；所述重组整合型自杀质粒pJKM带有SacB基因、抗生素标记和多克隆位点；(2)将所得自杀型敲除质粒pΔGOX1231转入宿主菌中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子，命名为G.oxydans ZJU1；(3)将所得自杀型敲除质粒pΔGOX1081转入经传代后的G.oxydans ZJU1中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取PDC基因敲除的阳性突变子，即得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，命名为G.oxydans ZJU2。