[发明专利]纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的制备方法与应用，本发明利用标准的两步阳极氧化法制备的纳米孔阵列，使用2‑羧乙基磷酸处理纳米孔阵列，进而固定人气味结合蛋白，将固定有人气味结合蛋白的纳米孔阵列固定于设计的反应皿中，获得所述传感器。采用电化学阻抗测试方法，及等效电路分析方法，本发明将人气味结合蛋白固定于纳米孔阵列上，用于检测与疾病相关的脂肪酸(二十二碳六烯酸)分子和醛类分子(苯甲醛)。本发明构建的电化学传感器检测灵敏度高，检测下限低。

主权项

1.一种纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)加工纳米孔阵列材料：采用标准的两步阳极氧化法制备；将纯度为99.99％以上的铝箔裁剪成长×宽为20mm×20mm的基片，进行机械抛光后依次在超纯水、丙酮溶液中，用超声脱脂清洗10min，取出后用超纯水淋洗，用氮气吹干后以基片作为阳极，铜片作为阴极在0.25M的草酸中进行一次氧化3h，然后用超纯水淋洗后把基片放入质量百分比为4％的铬酸和质量百分比为8％的磷酸混合液中进行5min刻蚀，除去一次阳极氧化多孔氧化铝层，然后用超纯水淋洗后进行15min的二次氧化，条件与第一次氧化条件完全相同，第二次刻蚀溶液为质量百分比为8％的磷酸和0.1M的氯化铜混合溶液，时间为5min，取出基片，用超纯水淋洗后即得到纳米孔阵列材料；(2)纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的构建，该步骤通过以下子步骤来实现：(2.1)首先，将纳米孔阵列材料裁剪成3mm*3mm的纳米孔阵列，面积大于反应皿中间通道，然后将其固定于反应皿的中间，再向反应皿的两侧中加入超纯水，浸泡24h后，依次用无水乙醇和超纯水清洗上述的反应皿及纳米孔阵列，最后用氮气吹干；(2.2)配制5mM的2‑羧乙基磷酸溶液，溶剂为超纯水；将2‑羧乙基磷酸溶液加入反应皿的两侧，2‑羧乙基磷酸溶液体积为使得纳米孔阵列恰好完全浸泡在2‑羧乙基磷酸溶液中；在室温下，避光静置72h，2‑羧乙基磷酸中的磷酸根吸附于纳米孔阵列的表面，进而将2‑羧乙基磷酸固定于纳米孔阵列上；之后再吸出反应皿中残留的2‑羧乙基磷酸溶液，然后用超纯水清洗反应皿及纳米孔阵列，最后用氮气吹干；(2.3)在反应皿的两侧分别加入8mg/ml的EDC(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和12mg/ml的NHS(N‑羟基琥珀酰亚胺)溶液，EDC溶液和NHS溶液的体积均为2‑羧乙基磷酸溶液体积的二分之一，EDC溶液的溶剂为0.1M MES缓冲液，NHS溶液的溶剂为0.1M PBS缓冲液，室温下静置15min后，再加入饱和NaHCO3溶液调节反应皿中溶液pH至7.2‑7.4；(2.4)在反应皿的两侧分别加入与EDC溶液等体积的20μg/ml人气味结合蛋白溶液，人气味结合蛋白溶液的溶质为人气味结合蛋白，溶剂为0.1M PBS缓冲液，内含质量百分比为5％的海藻糖和质量百分比为5％的甘露醇；将反应皿置于4℃条件下静置2h，使得人气味结合蛋白与2‑羧乙基磷酸溶液中的2‑羧乙基磷酸的羧基发生脱水缩合作用而形成稳定的酰胺键，进而形成酰胺键结构，然后吸出反应皿中残留的液体，再向反应皿两侧加满0.1M PBS缓冲液，静置5min后吸出PBS缓冲液，即可获得基于纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器，置于4℃条件下备用。