[发明专利]重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法

摘要

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，属于生物技术领域，具体涉及一种重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白的纯化方法，即将含有重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白的细胞上清依次经过亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、脱盐层析得到高质量的重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白。本发明具有成本低、目的蛋白纯度高、工艺过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。

主权项

1.一种重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：其具体步骤为：(1)用含1mol/L NaCl的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含1mol/L NaCl的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含NaCl的平衡缓冲液进行冲洗；(2)用pH值3.0～4.5的平衡缓冲液对步骤(1)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后进行病毒灭活；阴离子交换层析(3)用含1mol/L NaCl的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含NaCl的平衡缓冲液进行冲洗，再用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液进行冲洗；(4)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；阳离子交换层析(5)用含1mol/L NaCl的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行预平衡，再用不含NaCl的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含NaCl的平衡缓冲液进行平衡；(6)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；疏水作用层析(7)用含0.9mol/L(NH4)2SO4的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤(6)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含0.9mol/L(NH4)2SO4的平衡缓冲液进行平衡；(8)用含0.35～0.6mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；脱盐层析(9)用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液对脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后经过除病毒纳滤即获得目的蛋白原液；所述步骤(1)、(2)中所述的亲和层析，其介质选自rProteinA Fast Flow、Mabselect或Mabselect Sure；所述步骤(5)、(6)中所述的阳离子交换层析，其介质选自SP Sepharose Fast Flow、CM Sepharose Fast Flow或Capto S；所述步骤(7)、(8)中所述的疏水作用层析，其介质选自Phenyl Sepharose 6Fast Flow、Butyl Sepharose 4B或Butyl Sepharose 4Fast Flow；所述步骤(1)、(3)至(9)中所述的平衡缓冲液选自磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液、Tris‑HCl缓冲液或柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液，浓度为10～40mmol/L，pH值为5.5～8.0；所述步骤(2)中所述的pH值3.0～4.5的平衡缓冲液选自醋酸缓冲液或柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液，浓度为10～40mmol/L；所述步骤(3)、(4)、(6)、(8)、(9)中所述的盐选自Na2SO4、NaCl或(NH4)2SO4。