[发明专利]一种基于Pacbio RS II测序平台的HLA分型方法

摘要

本发明公开了一种基于Pacbio RS II测序平台的HLA分型方法，采集样本提取DNA，并进行PCR扩增，将PCR产物混合建10k文库，进行PacBio RS II测序；然后对测序得到的原始数据进行校正，利用软件程序进行HLA分型。相比于现有的HLA分型方法，本发明的HLA分型方法具有超高的分辨率，对临床移植组织配型、群体遗传学、人类学和进化学等应用和基础研究工作具有重要价值。

主权项

1.一种非诊断目的的基于Pacbio RS II 测序平台的HLA分型方法，包括以下步骤：1）采集样本提取DNA，然后进行PCR扩增，其中PCR扩增所用引物是针对需要分型的HLA基因的5’UTR和3’UTR区域设计的，且每对引物的5’端都加有用于区分样本的Barcode序列，其中，每个样本针对HLA‑A、HLA‑B、HLA‑C基因加的barcode一样，但是引物序列不一样，表1给出了两个样本的barcode和引物序列的信息；表1引物ID5'→3'序列A‑ID3FTACTAGAGTAGCACTCAACTCAGAGCTAAGGAATGATGGCAAATA‑ID3RGAGTGCTACTCTAGTAATATAACCATCATCGTGTCCCAAGGTTCB‑ID3FTACTAGAGTAGCACTCCCCGGTTGCAATAGACAGTAACAAAB‑ID3RGAGTGCTACTCTAGTAGGGTCCAATTTCACAGACAAATGTC‑ID3FTACTAGAGTAGCACTCTGCTTAGATGTGCATAGTTCACGAAC‑ID3RGAGTGCTACTCTAGTATGGACCCAATTTTACAAACAAATAA‑ID4FTGTGTATCAGTACATGAACTCAGAGCTAAGGAATGATGGCAAATA‑ID4RCATGTACTGATACACAATATAACCATCATCGTGTCCCAAGGTTCB‑ID4FTGTGTATCAGTACATGCCCGGTTGCAATAGACAGTAACAAAB‑ID4RCATGTACTGATACACAGGGTCCAATTTCACAGACAAATGTC‑ID4FTGTGTATCAGTACATGTGCTTAGATGTGCATAGTTCACGAAC‑ID4RCATGTACTGATACACATGGACCCAATTTTACAAACAAATA其中，引物ID中A、B、C分别代表HLA‑A、HLA‑B、HLA‑C基因；ID后面的数字表示样本代号，即barcode编号；F表示5’UTR端的引物，R代表3’UTR端的引物；2）将步骤1）得到的PCR产物混合建10k文库，然后进行PacBio RS II 测序；3）对测序得到的原始数据用Smrt analysisV2.3软件进行校正，得到高质量的CCS reads，并根据barcode序列和引物信息把不同样本的不同HLA基因的reads序列分开，分选原则是reads的头部或者尾部有100%匹配的barcode和引物信息，得到不同样本的不同HLA基因的reads序列信息；4）采用软件程序进行HLA分型，包括：4‑1）根据等位基因上的特异性位点将各样本的各HLA基因的reads序列分成两份文件，一份为等位基因1，另一份为等位基因2，具体是把CCS reads通过bwa软件与对应基因的参考序列进行比对，产生sam格式的比对结果，之后通过samtools的phase命令，分成两份fastq的结果文件；4‑2）采用Mira组装软件对各等位基因的文件分别截取20~40条reads进行序列组装；4‑3）针对polyC和polyG这些特定的motif对组装结果进行校正；4‑4）通过Lastz软件将校正后的组装结果与对应基因的基因组参考序列进行比对，并根据基因组参考序列的CDS位置信息将组装结果的所有CDS序列抓取出来，按照顺序连成一条CDS序列；4‑5）将步骤4‑4）得到的等位基因的CDS序列跟IMGT HLA型别数据库比对，如果100%的序列一样则将该型别号赋予该等位基因。