[发明专利]一种蚯蚓中蚓激酶的纯化方法

摘要

本发明公开了一种蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，该方法采用阳离子交换层析法和凝胶过滤层析法从蚯蚓的匀浆液中分离纯化一种具有纤溶活性的纤溶酶,离子交换层析过程中采用CM Sephadex C‑5作为填料，PBS作为配基，NaCl作为洗脱液。该组分经过SDS‑PAGE检测为混合成分。实验结果表明它具有较高的纤溶蛋白酶活性。此方法简洁方便，成本低，适用于规模化生产。

主权项

1.一种蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：第一步，蚯蚓组织匀浆制备：吐净泥沙后的蚯蚓采用组织匀浆机分别制备得到含有蚯蚓体腔液的混合液和剩余皮渣；将含有蚯蚓体腔液的混合液高速离心分别得到蚯蚓体腔液和体腔液中的沉淀部分；所述剩余皮渣和所述体腔液中的沉淀部分进行细胞粉碎，粉碎后的产物和所述的蚯蚓体腔液再次混合和离心，离心取上清液；第二步，硫酸铵沉淀法纯化蛋白组分：在所述的上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，加入完毕后搅拌8 ～ 15h，搅拌后离心，取沉淀；第三步，透析去盐：在第二步中的沉淀中加入PBS 缓冲液并摇匀至无沉淀，得到混合液；将该混合液灌入透析袋，并将透析袋置于PBS 缓冲液中，对透析后产物进行离心，离心后取上清液即为蚯蚓蛋白粗提物；第四步，CM Sephadex C‑50 阳离子交换层析：选用尺寸为40*700mm、预处理过的层析柱，在该层析柱中装入凝胶填料，装入填料后在层析柱顶端缓慢加入所述的蚯蚓蛋白粗提物，并用NaCl 进行阶段性梯度洗脱，流速为0.15 ～ 0.45ml/min，收集洗脱液；对洗脱液进行鉴定，选取具备溶解血栓功效的洗脱液，待用；该步骤中凝胶填料的制备方法为：按1g CM Sephadex C‑50 干粉加入30ml、0.2mol/L、pH ＝ 7.6 的PBS 缓冲液的比例进行配置，配置后在沸水浴中浸泡的同时缓慢搅动, 使组分混匀；第五步，Sephadex G‑75 凝胶过滤层析：选用尺寸为24*900mm、预处理过的层析柱，在该层析柱中装入凝胶填料，装入填料后，将第四步待用的洗脱液在层析柱顶端缓慢加入，并用蒸馏水进行洗脱，流速为1 ～ 2.5ml/min，收集洗脱液；该步骤中凝胶填料的制备方法为：按1g Sephadex G‑75 干粉加入20ml、0.2mol/L、pH＝ 7.6 的PBS 缓冲液的比例进行配置，配置后在沸水浴中浸泡的同时缓慢搅动，使组分混匀；其中：第二步中，上清液与饱和硫酸铵溶液的体积为1 ～ 3 ：1；第三步中，所述的PBS 缓冲液的pH＝ 7.6，浓度为0.2mol/L；第四步和第五步中，层析柱预处理均是依次用高锰酸钾和二甲基二氯硅烷处理管壁； 第四步中，蚯蚓蛋白粗提物的加入量为4 ～ 6mL；第四步的整个操作过程均在温度为4℃的条件下进行；该纯化方法还包括分子量测定，所述分子量测定是采用凝胶成像法； 第一步中所述的蚯蚓为大平2 号。