[发明专利]一种胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测方法

摘要

本发明公开了一种利用分子生物学方法检测胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的方法。胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测方法包括胰岛β细胞的培养、处理、细胞内蛋白的提取、胞浆蛋白的还原性western blotting实验、胰岛β细胞胞浆蛋白的非还原性western blotting实验、胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测等步骤。本发明克服了目前国外研究中利用放射自显影免疫印记技术研究了胰岛素原在胰岛β细胞内的折叠率，但是放射自显影免疫印记技术存在放射性污染、仪器设备昂贵的问题，用分子生物学技术来检测胰岛素原正确折叠率，为胰岛β细胞内胰岛素原的状态检测提供了新思路。

主权项

一种胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测方法，具体包括以下步骤： a、胰岛β细胞的培养：取复苏冻存细胞，用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM高糖培养基，在37℃、5%(v/v)CO₂的恒温培养箱中培养，每1~3天换液一次，常规传代；b、 胰岛β细胞的处理：待步骤a后MIN6分为4组继续培养，分组后细胞贴壁良好、密度适中时，分别换成含环孢素A的DMEM高糖培养基，药物浓度分别为0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L，干预MIN6细胞48小时；c、 胰岛β细胞内蛋白的提取：将步骤b处理后的细胞用细胞裂解液裂解，12000rpm离心30min后提取上清，得到胰岛β细胞胞浆蛋白，将提取的蛋白进行蛋白定量，把不同组蛋白溶液调整成同一浓度；d、 胰岛β细胞胞浆蛋白的还原性western blotting实验：取调整好浓度的蛋白溶液16ul，加入4ul 5×还原性蛋白质电泳缓冲液，沸水中煮沸5min，进行SDS‑PAGE蛋白质电泳，其中12%分离胶，5%浓缩胶，电泳后将胶中蛋白转移到5×8cm大小的PVDF膜，转膜完成后用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭2h，4℃过夜孵胰岛素一抗，孵完一抗用PBST洗膜3次，每次10min，室温2h孵鼠抗二抗，孵完二抗用PBST洗膜3次，每次10min，再用PBS洗膜一次，洗后曝光显影，得到胰岛素western blotting结果；e、 胰岛β细胞胞浆蛋白的非还原性western blotting实验：取调整好浓度的蛋白溶液16ul，加入4ul 5×非还原性蛋白质电泳缓冲液，不煮沸直接进行SDS‑PAGE蛋白质电泳，电泳后将胶中蛋白转移到5×8cm大小的PVDF膜，转膜完成后用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭2h，4℃过夜孵C肽一抗，孵完一抗用PBST洗膜3次，每次10min，室温2h孵兔抗二抗，孵完二抗用PBST洗膜3次，每次10min，再用PBS洗膜一次，洗后曝光显影，得到胰岛素原western blotting结果；f、 胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测：利用Quantity One软件对western blotting结果进行灰度分析，计算胰岛素原正确折叠率。