[发明专利]一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法

摘要

本发明属于植物原生质体培养领域，具体涉及一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，该方法采用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导。该方法将二倍体菊苣培养材料进行酶解、纯化、诱导、细胞团和小愈伤组织培养、愈伤组织繁殖和胚状体诱导、分化，得到再生芽。本发明利用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导处理，且每个步骤、各个参数之间协同作用，四倍体植株再生率较高；远高于采用原生质体融合方法诱导。

主权项

一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：酶解步骤：向二倍体菊苣培养材料中加入酶解液，进行酶解处理，得到酶解产物；将所述酶解产物进行收集处理，得到原生质体悬液；纯化步骤：将所述原生质体悬液进行清洗处理，再加入蔗糖溶液进行纯化处理，得到纯化后的原生质体；诱导步骤：将所述纯化后的原生质体放置于秋水仙素加倍液中，进行诱导处理，得到加倍后的原生质体；细胞团和小愈伤组织培养步骤：将所述加倍后的原生质体用原生质体培养基YJ1进行清洗处理，再用原生质体培养基JY2进行包埋培养，得到细胞团和小愈伤组织；愈伤组织繁殖和胚状体诱导步骤：将所述细胞团和小愈伤组织于原生质体培养基YJ3培养基进行诱导培养，得到愈伤组织和胚状体；分化步骤：将所述愈伤组织和胚状体于分化培养基JY4进行分化培养，得到再生芽；所述诱导步骤中，所述秋水仙素加倍液中，含有质量浓度百分比为0.1‑1％的秋水仙素；所述诱导步骤中，所述秋水仙素加倍液中，还含有10mM的CaCl2·2H2O，0.7mM的KH2PO4和质量百分比浓度为8％‑12％的甘露醇。所述原生质体培养基YJ1包括：KNO3：950mg/L,NH4NO3：168mg/L,MgSO4·7H2O：185mg/L,CaCl2·2H2O：440mg/L,KH2PO4：85mg/L；ZnSO4·7H2O：1mg/L,H3BO3：1mg/L,MnSO4·H2O：0.0758mg/L,CuSO4·5H2O：0.03mg/L,AlCl3：0.03mg/L,NiCl2·6H2O：0.03mg/L,KI：0.01mg/L；Na‑EDTA：37.3mg/L,FeSO4·7H2O：27.8mg/L；肌醇：150mg/L,VB1：10mg/L,VB6：1mg/L,VB5：1mg/L,烟酸：1mg/L,生物素：0.01mg/L,蔗糖：10000g/L,甘露醇：90000g/L；萘乙酸：0.5mg/L,TDZ：1mg/L；所述原生质体培养基JY2包括：KNO3：1900mg/L,NH4NO3：336mg/L,MgSO4·7H2O：370mg/L,CaCl2·2H2O：880mg/L,KH2PO4：170mg/L；ZnSO4·7H2O：2mg/L,H3BO3：2mg/L,MnSO4·H2O：0.1516mg/L,CuSO4·5H2O：0.06mg/L,AlCl3：0.06mg/L,NiCl2·6H2O：0.06mg/L,KI：0.02mg/L；Na‑EDTA：74.6mg/L,FeSO4·7H2O：55.6mg/L；肌醇：300mg/L,VB1：20mg/L,VB6：2mg/L,VB5：2mg/L,烟酸：2mg/L,生物素：0.02mg/L,蔗糖：20000g/L,甘露醇：180000g/L；萘乙酸：1mg/L,TDZ：2mg/L；另外添加0.8％低熔点琼脂糖；所述原生质体培养基YJ3包括：KNO3：950mg/L,NH4NO3：336mg/L,MgSO4·7H2O：185mg/L,CaCl2·2H2O：440mg/L,KH2PO4：85mg/L；ZnSO4·7H2O：1mg/L,H3BO3：1mg/L,MnSO4·H2O：0.0758mg/L,CuSO4·5H2O：0.03mg/L,AlCl3：0.03mg/L,NiCl2·6H2O：0.03mg/L,KI：0.01mg/L；Na‑EDTA：37.3mg/L,FeSO4·7H2O：27.8mg/L；肌醇：100mg/L,VB1：10mg/L,VB6：1mg/L,VB5：1mg/L,烟酸：1mg/L,生物素：0.01mg/L,蔗糖：5000g/L,甘露醇：50000g/L；萘乙酸：1mg/L,TDZ：1.5mg/L；Gelrite：4000mg/L；所述分化培养基JY4包括：KNO3：950mg/L,NH4NO3：504mg/L,MgSO4·7H2O：185mg/L,CaCl2·2H2O：440mg/L,KH2PO4：170mg/L；ZnSO4·7H2O：1mg/L,H3BO3：1mg/L,MnSO4·H2O：0.0758mg/L,CuSO4·5H2O：0.03mg/L,AlCl3：0.03mg/L,NiCl2·6H2O：0.03mg/L,KI：0.01mg/L；Na‑EDTA：37.3mg/L,FeSO4·7H2O：27.8mg/L；肌醇：100mg/L,VB1：1mg/L,VB6：1mg/L,VB5：1mg/L,烟酸：0.5mg/L,蔗糖：20000g/L,TDZ：0.15mg/L；Gelrite：4000mg/L。