[发明专利]一种依据遗传背景的微营养素矫正人基因组损伤的方法

摘要

本发明为一种依据遗传背景的微营养素矫正人基因组损伤的方法，属于营养基因组学和医学遗传学应用技术领域；本方法采集个体外周血，检测血液叶酸、血清VB12和Hcy水平，抽提核DNA，结合MTHFR C677T和A1298C基因型和个体的基因组损伤状况，依据各种血液微营养素维护基因组稳定的参考值(红细胞叶酸高于700nM、血清叶酸高于34nM、血清VB12高于300pM，以及血清Hcy低于8μM)，对基因组高损伤个体给予微营养素干预建议，以矫正个体的遗传损伤，进而维护基因组稳定性；本策略有利于预防心血管疾病，降低基因组损伤相关疾病危险度。

主权项

一种依据遗传背景的微营养素矫正人基因组损伤的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)血液叶酸水平检测：S1.血清获得：用促凝管采集个体外周血，然后放于4℃凝血1h，2500rpm离心15‑20min，黄色的上清为血清，分装为每个300μl，放于‑20℃避光保存；S2.血清叶酸水平检测：血清样本放室温解冻半小时后，将样本加入BECKMAN Access2全自动免疫分析仪进行检测，得到受检样本血清叶酸值；S3.红细胞获得：EDTA‑抗凝管采集个体外周血，1000rpm离心5‑10min分离红细胞，用生理盐水洗三次红细胞，1000rpm离心5min，将红细胞按1:21的比例稀释于质量浓度为0.2％的抗坏血酸溶液中，使细胞破碎，‑20℃避光保存；S4.红细胞叶酸检测：将破碎的红细胞样本放室温解冻半小时后，将样本加入BECKMAN Access2全自动免疫分析仪进行检测，得到受检样本红细胞叶酸值；(2)血清VB12和Hcy水平检测：S1.血清获得：用促凝管采集个体外周血，然后放于4℃凝血1h，2500rpm离心15‑20min，黄色的上清为血清，分装为一个300μl，放于‑20℃保存；S2.血清VB12水平检测：血清样本放室温解冻半小时后，将样本加入BECKMAN Access2全自动免疫分析仪进行检测，得到检测样本血清VB12值；S3.血清VB12水平检测：血清样本放室温解冻半小时后，将样本加入生化分析仪HITACHI 7600，检测样本血清Hcy值；(3)MTHFR基因型分析：S1.DNA提取：取外周全血200μl用北京天根公司DNA抽提试剂盒进行DNA抽提；S2.PCR扩增25μl体系：677引物序列：677F 5ˊ‑TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA‑3ˊ677R 5ˊ‑AGGACGGTGCGGTGAGAGTG‑3ˊ确定677位点反应体系，进行677位点的PCR程序；1298引物序列：1298F 5ˊ‑ATGTGGGGGGAGGAGCTGAC‑3ˊ1298R 5ˊ‑GTCTCCCAACTTACCCTTCTCCC‑3ˊ确定1298位点反应体系，进行1298位点的PCR程序；PCR结束后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果：含677位点的扩增片断为198bp，含1298位点的扩增片断为241bp，剩余产物于‑20℃冷冻保存；S3.限制性酶切：A、Hinf Ⅰ酶切677PCR产物依次加入10×Buffer 2μl，10μl PCR产物，1μl Hinf Ⅰ 10U限制性内切酶，灭菌双蒸水补至终体积为20μl，37℃水浴1h以上70℃灭活15min，3％琼脂糖凝胶电泳检测：CC型为单一198bp，CT型为198和175bp，TT型为单一175bp；B、Mbo Ⅱ酶切1298PCR产物依次加入10×Buffer 2μl，10μl PCR产物，1μl Mbo Ⅱ 10U限制性内切酶，灭菌双蒸水至终体积为20μl，37℃水浴1h后70℃灭活15min，3％琼脂糖凝胶电泳检测：AA型为单一204bp，AC型为241和204bp，CC型为单一241bp；S4.琼脂糖凝胶电泳及检测确定个体基因型：A、制胶：称取3％琼脂糖，溶于0.5×TBE中，微波炉加热，充分溶解后，按比例加入核酸染料，摇匀，倒入制胶槽，室温放置，待其凝固；B、琼脂糖凝胶电泳：加入10μl酶切产物点样，电压为100V，时间50‑60min；C、紫外检测：紫外分析仪检测电泳结果，根据检测结果确定PCR结果及两个位点的基因型；(4)评价与营养干预：红细胞叶酸高于700nM、血清叶酸高于34nM、血清VB12高于300pM，以及血清Hcy低于8μM是各种微营养素及代谢产物维护基因组稳定的参考值，对比参考值，结合个体MTHFR两个位点的基因型和基因组损伤状况，判断相关微营养素的是否缺乏，给予一定的营养干预策略，MTFHR两位点突变的个体应适当提高叶酸和VB12的摄入剂量，干预4‑6个月后，复检各生化指标及个体的基因组损伤，判断微营养素干预对不同个体基因组损伤的矫正效果。