[发明专利]病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系

摘要

本发明公开了一种病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系，根据八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的编码基因序列设计特异引物，通过RT‑PCR在石竹中扩增出大约500bp的cDNA片段。将获得的PDS cDNA片段连接到TRV2上，通过优化农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系，根据植株出现光漂白的频率、漂白的叶面积大小、漂白的状况，将乙酰丁香酮浓度、苗龄、侵染后预培养的温度以及预培养后植株的光照条件进行配套整合，建立了一套快速、有效的病毒诱导沉默体系，可以获得病毒诱导的基因沉默性状，进而解决有效验证石竹基因功能的问题。

主权项

1.病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、采用八氢番茄红素脱氢酶PDS的编码基因序列设计特异引物；S2、从石竹中克隆PDS基因，通过RT‑PCR在石竹中扩增出如SEQ ID NO：1所示的PDS基因片段，并将片段连接到pGEM T‑easy载体上；S3、将连接到载体pGEM T‑easy上的PDS片段用酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上；S4、将步骤S3所得的含上述PDS基因片段的pTRV2重组载体转入GV3101农杆菌中，进行阳性克隆的PCR鉴定；S5、室温下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液MES+MgCl₂+Aceto中活化4h后，采用浓度为1OOμmol L^‑1的乙酰丁香酮对4叶期的石竹幼苗室温下进行高压侵染，待叶片出现水渍状时，表明侵染完成；S6、将侵染后的石竹幼苗先放在15℃下预培养2d后，10℃下继续预培养5d；S7、然后步骤S6处理后的石竹幼苗放在20℃，光照为4000LUX的培养箱中进行培养，15‑20d后，出现叶片漂白现象。