[发明专利]对水产养殖环境沉积物中反硝化微生物的定量方法

摘要

本发明是一种对水产养殖环境沉积物中的反硝化微生物进行实时荧光定量PCR(qPCR)检测的方法，属于环境微生物生态学技术领域。内容包括各站位沉积物样品宏基因组DNA的提取和浓度测定，nirK和nirS基因的PCR扩增，标准质粒的构建，标准曲线的制作、qPCR扩增，根据qPCR的结果对照标准曲线计算样品中反硝化微生物的数量。本发明通过对nirK和nirS两种基因的定量分析，来确定水产养殖环境中反硝化微生物的数量，克服了16S rRNA基因无法在反硝化微生物定量中使用的缺点，和现有技术只关注某一功能基因造成的定量不全面的缺点，提供了一种特异性好、重复性高、准确度高的检测水产养殖环境中反硝化微生物数量的方法。本方法得到的nirK和nirS基因拷贝数的对数值与荧光阈值Ct值线性关系好，标准曲线的回归系数在0.99以上。

主权项

一种利用实时荧光定量PCR(qPCR)对水产养殖环境中反硝化微生物进行定量的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)宏基因组DNA提取：使用土壤DNA快速提取试剂盒，在核酸提取仪上对水产养殖环境沉积物样品DNA进行提取。(2)选取引物：根据水产养殖环境的特点，在现有特异性引物对中选取nirK基因引物F1aCu/R3Cu和nirS基因引物cd3aF/R3cd用于目的基因和荧光定量PCR的扩增。(3)标准质粒的构建：①目的基因nirK和nirS的扩增：使用步骤(2)中选取的引物，以步骤(1)中的宏基因组DNA为模板进行PCR扩增，分别得到nirK和nirS基因片段；②目的基因纯化产物的获得：将步骤(3)①中目的基因使用凝胶回收试剂盒进行纯化；③标准质粒的获得：将步骤(3)②中得到的目的基因nirK和nirS片段纯化产物与T载体连接，热激法转入到大肠杆菌感受态细胞DH 5α中，筛选鉴定，获得含有目的基因nirK和nirS的标准质粒，并进行序列测定。④标准质粒线性化：提取标准质粒DNA，并用限制性内切酶Nde I酶切过夜，使质粒线性化。然后在Modulus多功能光度计上检测质粒浓度。测得浓度的标准质粒进行10倍梯度稀释，制作浓度梯度标准品。⑤标准质粒分子量的计算：根据测序结果计算标准质粒的分子量，并按照以下公式计算含有目的基因的标准质粒的拷贝数：C＝6.02×10²³×C₀/M(其中C为拷贝数，C₀为质粒浓度，M为含有目的基因质粒的分子量)。(4)nirK和nirS基因qPCR扩增①qPCR扩增：将步骤1(1)中的宏基因组DNA样品测定浓度并统一调整浓度为10μg/μl，与步骤1(3)④中的浓度梯度质粒标准品DNA同时进行qPCR扩增，每个样品至少三个平行。②标准曲线的制作：以不同浓度质粒拷贝数的对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标绘制标准曲线。③反硝化微生物nirK和nirS基因拷贝数的计算：根据步骤(4)②中的标准曲线和样品Ct值计算样品中反硝化微生物nirK和nirS基因的拷贝数，计算养殖环境中反硝化微生物的数量。