[发明专利]一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法及其应用

摘要

本发明公开了一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法及其应用，利用点突变技术获得罗伊乳酸杆菌pheS基因的点突变基因pheSM，并将其与红霉素抗性基因构建整合框架LR‑pheSM‑em‑RR，电转化至L.reuteri XNY感受态细胞，红霉素筛选获得pheSM基因重组乳酸杆菌L.reuteri XNYM；然后，构建插入基因整合框架，再将其电转化至pheSM基因重组罗伊乳酸杆菌感受态细胞，利用对‑氯‑苯丙氨酸抗性筛选即可获得无抗性标记的重组乳酸杆菌。本发明不将抗性基因引入宿主菌基因组中，避免抗性基因的生物安全隐患以及对上下游基因的极性作用；利用该体系可对宿主菌进行多次基因定点整合。

主权项

1.一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据Genebank中公布的罗伊乳酸杆菌pheS基因序列设计特异引物，然后以罗伊乳酸杆菌L.reuteri XNY基因组DNA为模板扩增得到L.reuteri XNY的pheS基因；S2、利用软件将L.reuteri XNY的pheS基因与其它细菌的pheS基因进行比对，结合已发表文献确定pheS基因突变位点，再设计点突变引物利用重叠PCR技术获得pheS基因的点突变基因pheSM；S3、选取目的基因插入位点，以罗伊乳酸杆菌L.reuteri XNY基因组DNA为模板PCR扩增获得插入位点上下游700bp同源臂片段LR和RR；然后扩增启动子片段P、红霉素抗性基因EM片段，再利用重叠PCR技术将其与pheSM基因和同源臂片段连接，得到LR‑P‑pheSM‑EM‑RR整合框架；S4、将LR‑pheSM‑EM‑RR整合框架电转化至L.reuteri XNY感受态细胞，利用红霉素抗性筛选得到pheSM基因重组罗伊乳酸杆菌；S5、利用重叠PCR技术将所需插入的目的基因与插入位点两端的同源臂序列连接，得到目的基因整合框架，再将其电转化至pheSM基因重组罗伊乳酸杆菌感受态细胞，利用对‑氯‑苯丙氨酸(p‑Cl‑Phe)抗性筛选即可获得无抗性标记的目的基因整合菌株；所述步骤S2中所述的pheS基因点突变引物序列为：c：ATACGGCGGTTTTGGCTTTGGACTTGGACC；b：GGTCCAAGTCCAAAGCCAAAACCGCCGTAT；所述步骤S2中所述的pheSM基因是pheS基因第312位Ala突变为Gly的点突变基因：GCC312GGC。