[发明专利]一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用

摘要

本发明涉及一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用。本发明将来自Arthrobacter sp.L77菌株的麦芽寡糖海藻糖基合成酶基因、麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因和来自酿酒酵母中共价连接细胞壁的Pirlp蛋白成熟肽基因进行克隆，连接至毕赤酵母分泌表达载体pPIC‐ZαA中，构建表面展示两种酶的重组质粒pPIC‐ZαA‐MTSase‐MTHase‐Pir1p。利用α‐factor信号肽将重组蛋白引导分泌至细胞表面，麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶与Pir1p蛋白融合展示于菌体表面，实现两种酶在毕赤酵母的表面展示，从而实现双酶法生产海藻糖的高效应用。

主权项

1.一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以Arthrobacter sp. L77基因组为模板，F1和R1为引物，通过PCR扩增，获得MTSase基因片段；所述F1和R1的核苷酸序列如下所示：F1: GAATTCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC；R1：CCTCGGGGGTGAACGTGC；所述制备MTSase基因片段的PCR扩增体系如下：Hifi Mix 10 μl，10μM引物F1 10 μl，10μM引物R1 10 ul，ddH2O 7μl，Arthrobacter sp. L77基因组模板Template 1 μl；所述制备MTSase基因片段的PCR扩增程序如下：95℃变性5min；95℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；（2）Arthrobacter sp. L77基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR扩增，获得MTHase基因片段；所述F2和R2的核苷酸序列如下所示：F2: ATGAGTTCGCCATTCGAGGT；R2: GCGGCCGCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG；所述制备MTHase基因片段的PCR扩增体系如下：Hifi Mix 10 μl，10μM引物F2 10 μl，10μM引物R2 10 μl，ddH2O 7μl，Arthrobacter sp. L77基因组模板Template 1 μl；所述制备MTHase基因片段的PCR扩增程序如下：95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；（3）将步骤（1）制得的MTSase基因片段与步骤（2）制得的MTHase基因片段经重叠PCR扩增，电泳纯化，制得麦芽寡糖基海藻糖合成酶‑麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶目的基因；重叠PCR的上游引物为F2，下游引物为R1；所述制备MTSase‑MTHase融合基因片段的重叠PCR扩增体系如下：Hifi Mix 10 μl，10μM引物F1 10 μl，10μM引物R2 10 μl，ddH2O 7μl，MTSase基因片段和MTHase基因片段1 μl；所述制备MTSase‑MTHase融合基因片段的重叠PCR扩增程序如下：95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2.5min，5个循环；然后，补加引物F1和R2；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；（4）酵母基因组提取试剂盒提取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,CICC 32919)基因组DNA为模板，F3和F4为引物，通过PCR扩增，获得产物3 Pir1p基因片段；所述F3和F4的核苷酸序列如下所示：F3 ： GGACTAGTCAGAGAGCCGCTGCTAT；F4 ：GCTCTAGATTAACAGTTGAGCAAATCGAT；所述制备GenBank 序列号为D13740的目的基因Pir1p的PCR扩增体系如下：Hifi Mix 10 μl，10μM引物F3 10 μl，10μM引物F4 10 μl，ddH2O 7μl，酿酒酵母基因组模板Template 1 μl；所述制备GenBank 序列号为D13740的目的基因Pir1p的PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃最终延伸10min，4℃保存；（5）将步骤（3）制得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶‑麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶目的基因经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切后，与同样经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的pPIC‑ZαA载体连接，制得异源表达载体pPIC‑ZαA‑ MTSase‑MTHase；将异源表达载体pPIC‑ZαA‑ MTSase‑MTHase经限制性内切酶Spe I、Not I双酶切后，与经限制性内切酶Spe I、Not I双酶切的Pir1p基因片段连接，制得异源表达载体pPIC‑ZαA‑ MTSase‑MTHase‑Pir1p；（6）将步骤（5）制得的异源表达载体pPIC‑ZαA‑ MTSase‑MTHase‑Pir1p线性化后，采用电转化法转化毕赤酵母GS115，经筛选，获得表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的重组毕赤酵母。