[发明专利]一种分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法

摘要

一种分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法，涉及利用双向电泳技术在金山绣线菊中分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法。通过该技术分离纯化此酶，比传统的柱层析等方法具有更高的精确性、可操作性和先进性。方法：一、金山绣线菊梯度低温处理；二、金山绣线菊叶片蛋白提取；三、蛋白定量与纯化；四、第一向固相PH梯度等电聚焦电泳；五、第二向SDS-PAGE凝胶电泳；六、凝胶平衡与染色；七、凝胶扫描和图像分析；八、目标蛋白酶解与脱水；九、目标蛋白重结晶与纯化，完成分离纯化过程。用该方法使提取的蛋白酶具更高纯度、更多数量和更优科研价值，此方法提取纯化蛋白酶可用于酶活性、氧化还原与清除氧自由基机理、抗逆机制、抗逆基因克隆、蛋白组学等研究。

主权项

一种分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法，其特征在于是利用双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法，按以下方法进行：一、金山绣线菊梯度低温处理；二、金山绣线菊叶片蛋白质的提取：液氮充分研磨金山绣线菊叶片，加入蛋白提取试剂I，‑20℃静置过夜。低温过夜后提取液4℃离心2小时留取沉淀，用含0.07％β‑巯基乙醇约3倍沉淀体积的冷丙酮重悬沉淀后，在鼓风干燥装置中抽干沉淀。按30μl/mg比例加入蛋白提取试剂Ⅱ，冰浴后4℃离心1小时留取上清液。三、蛋白质定量与纯化：采用标准曲线法进行蛋白定量，按照2D‑Quant试剂盒说明进行蛋白纯化，纯化后的蛋白样品保存于‑80℃冰箱中待用。四、第一相固相PH梯度等电聚焦电泳：取蛋白样品溶液均匀滴加并充满胶条槽底部，将胶条轻覆于液层上，在IPGphor电泳仪上进行等电聚焦，聚焦电泳后将胶条分别放入平衡液A、平衡液B中平衡15min，再用双蒸水充分润洗沥干后进行第二相电泳。五、第二相SDS‑PAGE凝胶电泳：按常规制胶方法灌制凝胶，之后进行SDS‑PAGE凝胶电泳分离蛋白。六、凝胶平衡与染色：待电泳结束，蛋白充分分离后取出凝胶，放入固定液中固定，再将凝胶转移至热考染液中染色10分钟，蛋白斑点清晰染色后，凝胶放入乙酸液中脱色，脱色至凝胶背景呈无色状态。七、凝胶扫描和图像分析：用UMAX扫描仪扫描染色的聚丙烯酰胺凝胶并获取电子图像，利用专业分析软件2‑D Imagemaster ElitTM分析凝胶图像，给出各个染色蛋白点的实际分子量和等电点。八、目标蛋白胶内酶解与脱水：在凝胶上准确切取分子量为19.095KDa、PI值为8.98的蛋白点(目标蛋白)，在切取的胶团中加入4‑5μl含5ng/μl胰蛋白酶的25mM适量碳酸氢铵溶液，使胶团完全吸涨并酶解12‑14小时。将蛋白酶解体系放入60μl的50％乙晴液中脱水45分钟，再向乙腈液中加入16‑18μl0.5％的适量TFA，将蛋白脱水体系放在4℃摇床上振荡三小时，最后放入真空干燥超速离心机中旋转干燥成白色胶粒。九、目标蛋白的重结晶与纯化：在AnchorChipTM板点样孔上均匀涂上一层CCA基质，将酶解和脱水后的目标蛋白胶粒放入点样孔内，滴入0.1％TFA到样品上并充满点样孔，使胶粒迅速溶解并润洗蛋白，1分钟内吸出点样孔内所有溶液以除去操作中对蛋白造成的污染，并重复3次。加入微量重结晶液使蛋白结晶析出保存；其中步骤二中的蛋白提取试剂I的主要成分包括：10％三氯乙酸丙酮溶液，0.07％β‑巯基乙醇；蛋白提取试剂Ⅱ的主要成分包括：7.0mol/L尿素，40mmol/L二硫苏糖醇，4％两性电解质表面活性剂，2.0mol/L硫脲；步骤四中的平衡液A的成分包括：50mmol/L Tris‑HCI，pH6.8，8mol/L尿素，30％甘油，1％十二烷基硫酸钠，0.2％二硫苏糖醇；平衡液B的成分包括：以3％碘乙酰胺替换平衡液A中的0.2％二硫苏糖醇并加痕量溴酚蓝，其他成分相同；步骤六中固定液主要成分为：40％乙醇：10％乙酸(3:1)；热考染液配制：微量R350溶于1600ml冰乙酸。步骤九中的重结晶液的成分包括：0.1g CCA溶于6:3:1的乙醇：丙酮：0.1％TFA溶液。