[发明专利]通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法

摘要

本发明主要涉及利用CRISPR/Cas9技术，设计独特的一段PAM区，使得斑马鱼中的铁调素基因被敲除，又不“误伤”其他基因，形成调素敲除的斑马鱼。作为首例铁调素敲除转基因的模式动物斑马鱼的意义重大，铁调素是调控铁的主要因素，一旦被敲除，即成功动物模成铁过载的模式动物，可以排除人为因素干预，对于研究铁的表达研究意义重大，同时与传统敲除基因的技术相比，CRISPR/Cas9技术具有毒性小，准确性高，效率高，成功周期短等特点；使得铁调素基因更快得被敲除。

主权项

通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)在铁调素基因第一个外显子和内含子之间设计gRNA序列，gRNA序列为CCAAGCGCCAAGTCACCTTTCC；(2)设计并合成gRNA引物，引物序列为P3:Forward sequence(5’to3’):TAACGTGTTTCTGGCTGCTG,P4:Reverse sequence(5’to3’):AAAAGCACCGACTCGGTGCC；(3)以上述的引物、gRNA‑plasmid为模板进行PCR反应，PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环：95℃‑20s、58℃‑20s、72℃‑20s共30个循环，然后72℃‑10min，最后保温在16℃；电泳检测PCR产物后，进行纯化；(4)RNA‑Free条件下，将上述的PCR产物进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7聚合酶和NTP，37℃，1hour反应完毕，然后进行纯化；(5)将前述纯化后的gRNA和Cas9蛋白显微注射到单细胞的斑马鱼胚胎中，24小时后提取DNA进行测序检测；(6)3‑4个月后斑马鱼性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到一定概率的杂合子，将胚胎进行RNA提取并逆转录成DNA送测序查看是否有突变，这时候的DNA还是双链的；(7)将测序后发现突变的斑马鱼的cDNA和19T载体相连接后，将其在培养基中滚珠图板，经过12‑14小时后，已经连接的质粒会以斑点形式成长，将其挑斑后，这时候得到的是单链的DNA，再次送测序，最终得到单链的突变，这时候为真正杂合的突变体，然后将其培养长大；(8)经过3‑4个月后性成熟后，第二代的突变成年的雄鱼与雌鱼再次切除尾巴，进行鉴定，突变的斑马鱼再次交配，从而得到纯合的铁调素敲除的斑马鱼。