[发明专利]一种用于扩增灰葡萄孢菌四个基因的方法及其多重PCR引物组

摘要

一种用于扩增灰葡萄孢菌四个基因的方法及其多重PCR引物组涉及分子生物学领域。本发明是在已知灰葡萄孢菌对苯并咪唑类、啶酰菌胺类、异菌脲和环酰菌胺等多种杀菌剂的抗药性突变位点的基础上，建立的一种用于同时扩增β‑tub、BsOS1、erg27、SdhB四种基因片段的PCR引物组。本发明可直接采用提取的灰葡萄孢菌基因组作为模板，用设计的引物组对模板进行扩增，获得富集的四个基因片段。本发明是首次采用多重PCR方法对灰葡萄孢菌的四个抗药性突变基因进行同时扩增，为后期抗药位点的检测大大减少了工作量。本发明经过对PCR反应体系的优化，将四个基因片段在同一PCR反应中进行扩增。

主权项

一种用于扩增灰葡萄孢菌四个抗药相关基因的方法，其特征在于共分两步：第一步：提取灰葡萄孢菌基因组第二步：进行PCR反应：采用四对引物，分别用于扩增灰葡萄孢菌β‑tub、BcOS1、erg27、SdhB基因，四对引物分别为SEQ ID NO:1 CGATACCGTTGTCGAGCCATSEQ ID NO:2 GGTTGCTGAGCTTCAAGGTTSEQ ID NO:3 ACACCGACCCAGCACCAGASEQ ID NO:4 TTAGCAATAACCGCCCAAASEQ ID NO:5 CACCCGCGTAGCAAGAGATGSEQ ID NO:6 TGAGTCAGGTCTCCCTTTGCSEQ ID NO:7 ATCATGCCCTTGAATTTTGTGSEQ ID NO:8 CTTTGCCTCCCCTTTCTTCTCPCR反应混合液中含有提取的待测样品的基因组DNA作为PCR反应的模板，反应体系如下，PCR反应程序：94℃5min；94℃30sec，59℃30sec，72℃20sec；72℃10min。