[发明专利]一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法

摘要

本发明涉及用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，有效解决简便、低廉、安全的用于观察植物中单宁类物质分布结构的问题，方法是，将植物切成1mm3的小块，切块置入浸渍液中浸渍2—16h，再置入锇酸固定1~2h，用蒸馏水漂洗5min，用乙醇溶液脱水；将Epon 812用乙醇渗透，静置12h；将切块包入胶囊或包埋板中，加入Epon 812，加热，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；将包埋块修整成梯形，切成厚度60~80μm的切片，制干；将切片用绿茶提取液染色，用蒸馏水洗涤三次，室温晾干，本发明方法简单，易操作，成本低，安全，污染少，成功率高，效果好，有效用于观察植物细胞中单宁类物质分布结构，是植物切片染色上的一大创新。

主权项

一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，其特征在于，具体步骤是：（1）、切块：在室温下，将植物切成1mm3的小块，0~4℃保存；（2）、浸渍和固定：首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛3%~9%、咖啡碱0.5‑2.5%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液，切块置入浸渍液中浸渍2—16h，开始时，每0.5‑1h更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1%~2%的锇酸固定液固定1~2h；（3）、漂洗：从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；（4）、脱水：在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水10~20min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2‑3次，每次10‑20min；（5）、渗透：采用梯度对Epon 812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为3︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40℃下静置12h；（6）、包埋和聚合：将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon 812，放烘箱中加热，35℃加热12h ，45℃加热12h ，60℃加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；（7）、修块：将包埋块经粗修，修整成梯形；（8）、切片：将梯形包埋块切成厚度60~80μm的切片，制干；（9）、染色：将切片相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.2‑0.5%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好蜡盘染色10‑30分钟；所述的蜡盘是由培养皿中浇铸融化的石蜡，冷却后制成；所述的绿茶提取液，取绿茶1kg，粉碎，45‑50℃下，用体积浓度70%乙醇8L浸渍30min，过滤，滤液在50℃下用旋转蒸发仪去除乙醇，浓缩得到浸出物，将浸出物在真空干燥箱中40 ℃干燥24h，得到粗提物，磨碎，4℃保存，使用时用水稀释成所需体积浓度0.2‑0.5%的绿茶提取液；（10）、漂洗：取出切片，用蒸馏水洗涤三次，滤纸吸出水分，室温晾干；（11）、镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥，在透射电镜下观察照相，得结构清晰的图像。